糖尿病是一種多病因綜合作用導(dǎo)致的代謝性疾病，其特點(diǎn)是慢性高血糖，伴隨因胰島素分泌不足和（或）作用障礙引起的糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝紊亂。世界衛(wèi)生組織將糖尿病主要分為兩類：Ⅰ型糖尿病，主要原因是胰腺β-細(xì)胞遭到破壞，導(dǎo)致血漿胰島素水平低下；Ⅱ型糖尿病，是一種非感染性慢性代謝綜合征，其特點(diǎn)是胰島素分泌受損和靶組織對胰島素作用的抵抗而導(dǎo)致的高血糖。據(jù)統(tǒng)計，Ⅱ型糖尿病是世界范圍內(nèi)最常見的糖尿病，占所有糖尿病患者的90%以上，被認(rèn)為是主要的公共衛(wèi)生問題。預(yù)計2030年糖尿病將成為人類第七大致死因素，被公認(rèn)為“無聲殺手”。預(yù)計到2035年，受影響的人數(shù)將增加到5.92億。世界衛(wèi)生組織最近公布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，全世界大約有15億成年人超重和肥胖，這使他們具有患糖尿病的潛在風(fēng)險。

在食物消化過程中，淀粉被α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶共同作用水解成單糖，抑制這些酶的活性可顯著降低餐后血糖升高。抑制淀粉水解和葡萄糖的吸收是預(yù)防Ⅱ型糖尿病的有效途徑。近些年來，膳食活性成分在預(yù)防慢性疾病中的作用受到廣泛關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計，目前有800余種植物提取物可能對糖尿病的治療起積極的作用。關(guān)于植物提取物作為淀粉消化酶抑制劑的研究成為熱點(diǎn)。梔子是我國治療糖尿病傳統(tǒng)藥物，是一種含有多種有效活性成分的藥食兩用資源，具有抗炎、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等多種藥理作用。肖小華等報道梔子黃含量為1.67g/mg時能顯著降低不同糖負(fù)荷的小鼠血糖，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)梔子提取物對α-葡萄糖苷酶產(chǎn)生抑制作用的有效部分可能是環(huán)烯醚萜和梔子黃色素類。Zhou等通過研究梔子對治療Ⅱ型糖尿病的動物實(shí)驗(yàn)糞便組學(xué)從側(cè)面證實(shí)了梔子黃的降糖效果。李春英等報道梔子黃抑制α-葡萄糖苷酶活性，然而，具體作用機(jī)制不詳。本研究探討梔子黃對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的影響及其作用動力學(xué)，通過光譜特征分析兩種淀粉消化酶結(jié)構(gòu)變化，揭示梔子黃對餐后血糖升高的抑制作用機(jī)制，以期為糖尿病患者功能產(chǎn)品的開發(fā)提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

梔子黃（色價500），河南中大恒源生物科技有限公司；小麥淀粉（含水量12.89%），泰州市好食惠調(diào)味品有限公司；α-淀粉酶（50U/mg），美國Sigma公司；α-葡萄糖苷酶（7000000U/mL），上海源葉生物科技有限公司；4-硝基苯基-α-D-吡喃葡糖苷（PNPG），麥克林生化科技有限公司；3，5-二硝基水楊酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。其余試劑均為分析純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1600B紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FA1004電子分析天平，上海上平儀器公司；MultiskanFC96孔酶標(biāo)儀，賽默飛世爾儀器有限公司；G9800A熒光分光光度計，安捷倫科技有限公司；MVS-1旋渦混合器，北京金北德工貿(mào)有限公司；SHZ-82數(shù)顯水浴恒溫振蕩器，金壇華峰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 梔子黃對α-淀粉酶抑制動力學(xué)研究

使用米氏方程（Michaelis-Menton）和LineweaverBurk方程確定梔子黃對α-淀粉酶的抑制方式。以小麥淀粉溶液作底物磷酸鹽緩沖液溶解后在80℃的水浴鍋中糊化30min。淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%，1.0%，1.5%，2.0%。梔子黃溶液質(zhì)量濃度定為0.5，0.7mg/mL。向具塞試管中先加入不同濃度梔子黃溶液250μL，再添加250μLα-淀粉酶溶解液37℃振蕩10min，再加入500μL不同濃度的底物溶液，每隔5min取出相對應(yīng)的試管并加入2.0mLDNS顯色劑沸水中加熱5min后冷卻至室溫，定容至25mL，540nm處測量其吸光度。

1.3.2 梔子黃對α-葡萄糖苷酶抑制動力學(xué)研究

α-葡萄糖苷酶與α-淀粉酶的試驗(yàn)方法大致相同。梔子黃溶液濃度仍然為0.5，0.7mg/mL，試驗(yàn)中需要將作為底物的PNPG溶液的濃度范圍設(shè)定為0.5～5.0mmol/L。向96孔酶標(biāo)板中先加入80μL磷酸鹽緩沖溶液按設(shè)定加入20μL不同濃度的梔子黃溶液和60U/mL的α-葡萄糖苷酶溶液，37℃氣浴振蕩10min后加入20μLPNPG底物溶液，每隔5min取出酶標(biāo)板并加入100μL的0.2mol/L的碳酸鈉溶液終止反應(yīng)，用96孔酶標(biāo)儀在405nm處測定吸光度。具體的方程計算情況與上述的α-淀粉酶的過程相一致。

1.3.3 α-淀粉酶熒光光譜測定

探究不同濃度梔子黃對α-淀粉酶的熒光猝滅光譜。在磷酸鹽緩沖液中配置質(zhì)量濃度0.025，0.1，0.3，0.5，0.7，1mg/mL的梔子黃；將α-淀粉酶（300U/mL）溶解到pH6.8的磷酸鹽緩沖液中，在3mL的α-淀粉酶的溶液中加入0.2mL不同濃度的梔子黃漩渦振蕩2min定容至10mL。將混合液分別在30℃和37℃的水浴條件下恒溫振蕩30min。以等量的梔子黃溶液為空白參比，激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長290nm，狹縫寬度5nm，在290～500nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描。

1.3.4 α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析

α-葡萄糖苷酶熒光光譜分析與α-淀粉酶類似，其中α-葡萄糖苷酶的酶活力大小為180U/mL激發(fā)波長278nm，發(fā)射波長290nm，狹縫寬度5nm，在290～450nm波長范圍下進(jìn)行熒光發(fā)射光譜掃描。其中的對照試驗(yàn)與上述α-淀粉酶的方法與操作相同。

同步熒光光譜試驗(yàn)與1.3.3節(jié)過程大致相同，在上述熒光猝滅試驗(yàn)基礎(chǔ)上，將參數(shù)改變?yōu)椋?alpha;-淀粉酶，α-葡萄糖苷酶均在波長200～400nm范圍內(nèi)，通過設(shè)定激發(fā)波長間隔和發(fā)射波長間隔在△λ=15～60nm的設(shè)定下進(jìn)行熒光光譜掃描。
酶的抑制動力學(xué)可以通過以下方程表示：

Michaelis-Menton方程：

不同I下的雙倒數(shù)直線得出斜率Slope。利用I和Slope再次作圖得出K_ic。方程如下：

將斜率（Slope）或截距（Y-intercept）與I的二次重繪圖并進(jìn)行線性擬合。式（1）、（2）、（3）、（4）中：V—初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；S—底物質(zhì)量濃度，mg/mL；V_max—最大初始反應(yīng)速度，mg/mL/min；I—抑制劑質(zhì)量濃度，mg/mL；α—表觀系數(shù)；Km—米氏常數(shù)；K_ic—競爭性抑制常數(shù)；Kiu—非競爭性抑制常數(shù)。

熒光猝滅通過Stern-Volmer方程描述：

式（5）中：F₀和F—分別為不存在和存在猝滅劑時熒光物質(zhì)的熒光強(qiáng)度；Ksv和Kq—分別為Stern-Volmer猝滅常數(shù)和受擴(kuò)散過程控制的雙分子熒光猝滅速率常數(shù)；[Q]—猝滅劑質(zhì)量濃度，mg/mL；τ₀—熒光分子平均壽命（α-淀粉酶的τ₀為2.97ns，α-葡萄糖苷酶的τ₀為10^-8s）。

相關(guān)鏈接：α-葡萄糖苷酶，α-淀粉酶，梔子黃，5-二硝基水楊酸

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