隨著生活質(zhì)量的提高，人們?nèi)粘Ｉ钪袑Ω咧?、高糖、高能量飲食的攝入增加，導(dǎo)致高血脂癥患病人群數(shù)量增加，高血脂癥已成為世界關(guān)注的重點(diǎn)問題。預(yù)防與治療高脂血癥的方法有運(yùn)動鍛煉、控制飲食和藥物治療等方式，其中藥物治療方式效果雖好，但是有毒副作用。有研究表明天然產(chǎn)物中含有許多降血脂的物質(zhì)，從天然產(chǎn)物中開發(fā)降血脂的物質(zhì)成為當(dāng)今研究熱點(diǎn)。

粗毛纖孔菌Inonotushispidus（Bull.）Pat.，又名粗毛黃褐孔菌，是一種非常珍貴的藥用真菌。粗毛纖孔菌作為一種藥用真菌，具有抗腫瘤、抑菌、抗氧化、降血脂、提高免疫力等生物活性。目前已經(jīng)從粗毛纖孔菌中分離得到多種具有生物活性的化合物，包括多糖類、三萜類和酚類等。多糖作為粗毛纖孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗腫瘤、抗氧化、降血糖等作用。但提取方法對有效活性成分的提取效果以及活性的影響很大。張倩等研究熱水浸提和超聲微波協(xié)同提取對枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影響，結(jié)果表明超聲微波協(xié)同法得到的枸杞多糖提取率顯著高于熱水浸提法，且超聲微波協(xié)同法得到的多糖對自由基的清除能力比熱水浸提法更好。蘇平等研究四種不同輔助提取方法對黃秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影響，四種方法對比發(fā)現(xiàn)酶法提取的黃秋葵花多糖提取率最高，四種方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超聲輔助提取的多糖表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性。馬舒?zhèn)サ妊芯坎煌椒▽π⒍嗵菃翁墙M分和抗氧化活性的影響，不同方法提取的玄參多糖對比發(fā)現(xiàn)，酶輔助提取法提取的玄參多糖的純度最高，體外抗氧化活性最強(qiáng)。

超聲微波協(xié)同輔助提取法充分利用了超聲波震動的空化作用與微波的高能效應(yīng)和熱效應(yīng)，將超聲微波相結(jié)合，既能縮短提取時間，又可以提高提取效率，從而實(shí)現(xiàn)高效快速的處理樣品，有學(xué)者采用微波超聲組合提取猴頭菇多糖與熱水提取法、超聲波提取法和微波提取法相比，發(fā)現(xiàn)微波超聲聯(lián)用組合具有節(jié)省時間和多糖浸出率高等優(yōu)點(diǎn)。因此為提高粗毛纖孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken試驗設(shè)計研究了超聲微波協(xié)同制備粗毛纖孔菌多糖的工藝，并與微波輔助提取法和熱水提取法對比分析了粗毛纖孔菌多糖提取率及體外膽酸鹽結(jié)合能力，以期為把粗毛纖孔菌多糖開發(fā)成為一種降脂功能性食品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗毛纖孔菌子實(shí)體于2020年9月采自東北林業(yè)大學(xué)林場；葡萄糖、濃硫酸、苯酚國產(chǎn)分析純；甘氨膽酸鈉、?；悄懰徕c、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250）上海源葉生物生物科技有限公司。Scientz-IIDM型微波光波超聲波萃取儀寧波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速萬能粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；722s型紫外分光光度計上海第三分析儀器廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上海亞榮生化儀器公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水真空泵鄭州長城科工貿(mào)有限公司；GL10048型萬分之分析天平上海佑科儀器儀表有限公司；TDL40BW型臺式離心機(jī)上海星科科學(xué)儀器有限公司；HH-4型電熱恒溫水槽上海力辰儀器科技有限責(zé)任公司。

1.2 實(shí)驗方法

1.2.1 材料處理

將采摘的新鮮粗毛纖孔菌子實(shí)體于烘箱中60℃烘干，高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩，備用。

1.2.2 超聲微波協(xié)同制備粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖工藝

1.2.2.1 單因素實(shí)驗

準(zhǔn)確稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，加入一定體積的蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬蠓胖梦⒉ü獠ǔ暡ㄝ腿x中，固定實(shí)驗參數(shù)料液比1:30g:mL，超聲時間30min，超聲功率200W，微波時間30s，微波功率300W，分別考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50g:mL），超聲時間（10、20、30、40、50、60min）、超聲功率（100、200、300、400、500W）、微波時間（10、20、30、40、50、60s）、微波功率（100、200、300、400、500、600W）對超聲微波輔助提取粗毛纖孔菌多糖提取率的影響，將制備得到的多糖提取液在4000r/min離心15min，上清液即為粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖溶液，殘渣按上述步驟復(fù)提兩次，合并提取液。在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上60℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，冷卻后測多糖含量。得出五個單因素對IHP提取率的影響，最終根據(jù)單因素實(shí)驗結(jié)果確定響應(yīng)面試驗的因素和水平。

1.2.2.2 響應(yīng)面設(shè)計

根據(jù)單因素的實(shí)驗結(jié)果，使用Design-Expert8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，因素水平表見表1。根據(jù)響應(yīng)面試驗結(jié)果，建立數(shù)學(xué)模型，確定IHP的最佳提取條件。

1.2.3 不同提取方法對粗毛纖孔菌多糖提取率的影響

將優(yōu)化后的超聲微波輔助法對IHP的提取率與熱水浸提法和超聲輔助法進(jìn)行對比。超聲微波輔助提取法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅糜诜胖梦⒉ü獠ǔ暡ㄝ腿x中，設(shè)定超聲時間51min，超聲功率200W，微波時間50s，微波功率500W進(jìn)行提取，離心取上清液，測多糖含量。熱水浸提法和超聲輔助法采用預(yù)實(shí)驗優(yōu)化得到的工藝條件。熱水浸提法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬螅?0℃水浴浸提3h，提取結(jié)束后，離心取上清液，測多糖含量。超聲輔助法：稱取一定量的粗毛纖孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸餾水，充分?jǐn)嚢韬?，置于放置微波光波超聲波萃取儀中，設(shè)置超聲功率200W，超聲時間1h，提取結(jié)束后，離心取上清液，測多糖含量。

1.2.4 粗毛纖孔菌多糖含量的測定

1.2.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用苯酚-硫酸法測定糖含量[21]準(zhǔn)確稱取經(jīng)真空干燥恒重的葡萄糖40mg，于500mL容量瓶中定容配制成80μg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液，取2.0mL蒸餾水為空白樣，用移液槍依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液于具塞試管，各管補(bǔ)加蒸餾水至2.0mL，加入6%苯酚1mL，98%濃硫酸5mL，靜置10min后振蕩混勻，室溫下靜置20min后，充分反應(yīng)，于490nm下測定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的線性回歸方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于計算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的測定

準(zhǔn)確吸取2mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0mL和98%濃硫酸5.0mL，靜置10min后振蕩混勻，在室溫下放置20min，于490nm下測定OD值。若測得樣品多糖濃度不在測量范圍內(nèi)，應(yīng)當(dāng)稀釋再次測量。粗毛纖孔菌多糖的提取率為提取液中的多糖與總多糖的比值，在預(yù)實(shí)驗中，采用熱水法反復(fù)多次提取確定了粗毛纖孔菌子實(shí)體多糖含量為16.4%。提取率計算公式為：

式中：C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算得到的粗毛纖孔菌水提液液所含多糖的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為粗毛纖孔菌水提液總體積，mL；N為溶液最終的稀釋倍數(shù)；k為粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末的重量，g；m為1g粗毛纖孔菌子實(shí)體粉末總多糖含量，%。

1.2.5 體外降脂實(shí)驗

1.2.5.1 膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

膽酸鹽測定方法參照文獻(xiàn)分別取不同濃度的膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液（甘氨膽酸鈉0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3mmol/L，?；悄懰徕c0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mmol/L），2mL于具塞試管中，向每管標(biāo)準(zhǔn)溶液中依次加入6mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%的H₂SO₄，70℃恒溫水浴鍋中水浴20min，取出后進(jìn)行冰浴5min，在387nm處測定吸光度，分別作兩種膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程，牛黃膽酸鈉的回歸方程為y=2.8591x-0.0176，R²=0.9957，可以用于計算?；悄懰徕c含量。甘氨膽酸鈉的回歸方程為y=1.5012x+0.0536，R²=0.9957，可以用于計算甘氨膽酸鈉含量。

1.2.5.2 粗毛纖孔菌多糖膽酸鹽結(jié)合能力的測定

粗毛纖孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4℃醇沉24h，離心，去除上清液，沉淀即為粗毛纖孔菌粗多糖，將粗多糖用蒸餾水配制成20mg/mL多糖溶液分別吸取1mL粗毛纖孔菌粗多糖溶液于100mL具塞三角瓶中，加入1mL10mg/mL胃蛋白酶，3mL0.01mol/L的HCl溶液，在37℃恒溫振蕩，模擬胃環(huán)境（pH為1.5）消化1h；以0.1mol/L的NaOH溶液調(diào)節(jié)溶液pH至6.3，再加入4mL10mg/mL胰蛋白酶，模擬腸道環(huán)境進(jìn)行消化1h，加入4mL1mmol/L膽酸鹽消化1h，4000r/min離心20min，取上清液，比色測定膽酸鹽含量，平行3次實(shí)驗。甘氨膽酸鈉和?；悄懰徕c結(jié)合率按下式計算。

式中：c₁為甘氨膽酸鈉加入量，μmol，c₂為甘氨膽酸鈉剩余量，μmol，c₃為牛磺膽酸鈉加入量，μmol，c₄為?；悄懰徕c剩余量，μmol。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗重復(fù)三次，試驗中的數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析（analysisofvariance，ANOVA）單因素方差分析，數(shù)據(jù)以表示，組間做t檢驗，P＜0.05則表示有顯著性差異，有統(tǒng)計學(xué)意義。

相關(guān)鏈接：硫酸，?；悄懰徕c，胃蛋白酶，胰蛋白酶

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