發(fā)酵食品是一種傳統(tǒng)的食物保存方法，據(jù)《美國心臟病學(xué)院雜志》報(bào)道，發(fā)酵食品中所含的益生菌有益于心臟健康。有學(xué)者指出：發(fā)酵食品中的益生菌有利于改變腸道中的微環(huán)境，通過調(diào)節(jié)人的腸道菌群來緩解社會(huì)焦慮癥。發(fā)酵冬瓜（smellywaxgourd，SWG），又稱“臭冬瓜”，是浙東地區(qū)傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，因其獨(dú)特的風(fēng)味而被稱為開胃菜。冬瓜在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量的微生物，其中優(yōu)勢菌是乳酸菌，它通過分解碳水化合物產(chǎn)生乙醇、脂肪酸和過氧化物降低了腸道的pH，抑制了細(xì)菌病原菌的生長。發(fā)酵冬瓜還產(chǎn)生可具有調(diào)節(jié)健康潛力的物質(zhì)，如維生素B、葉酸等，也合成具有神經(jīng)遞質(zhì)和免疫調(diào)節(jié)功能的氨基酸及其衍生物。冬瓜在發(fā)酵中通常產(chǎn)生大量的微生物，這些微生物中有相當(dāng)大一部分通過人類消化道存活。

腸道菌群是近年來人們最為關(guān)注的焦點(diǎn)之一，一個(gè)人的身體健康狀況不僅取決于自身的遺傳因素，而且還與人體腸道微生物組成成分密切相關(guān)。特定的飲食成分對(duì)腸道菌群的組成成分以及小分子代謝產(chǎn)物的形成具有深遠(yuǎn)的影響，這些微生物可以直接或間接地通過腸上皮影響機(jī)體的代謝機(jī)制，當(dāng)飲食發(fā)生變化時(shí)，腸道菌群結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一系列的變化。飲食影響腸道菌群，進(jìn)而影響宿主的生理功能、免疫應(yīng)答或生長性能。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）是一種廣泛分布于環(huán)境中的革蘭氏陽性球菌，在人和家畜的體表尤其在和外界相通的腔道中檢出率相當(dāng)高，也是冷藏食品和鹽漬食品重要的致病性微生物，通過分泌豐富的毒力分子阻斷人體免疫反應(yīng)，使得細(xì)菌逃避來自宿主免疫系統(tǒng)的攻擊，造成人類廣泛的疾病，如膿皰病、菌血癥和肺炎等。盡管目前已有相關(guān)研究表明，可通過生物學(xué)方法制備特異性受體靶向作用于金黃色葡萄球菌毒素，從而達(dá)到保護(hù)機(jī)體的目的，但仍然存在諸多問題。例如，研究人員發(fā)現(xiàn)，一種特異的小分子球狀蛋白Centyrins（～10kDa），能夠靶向金黃色葡萄球菌分泌的殺白細(xì)胞素（Leukocidins），從而使宿主免受毒素侵害，但由于金葡菌具有耐藥性強(qiáng)、易變異等特點(diǎn)，使得這種單靶點(diǎn)治療方法失敗率較高。因此，本文嘗試采用發(fā)酵冬瓜探究其對(duì)金黃色葡萄球菌感染小鼠的緩解作用，實(shí)驗(yàn)用發(fā)酵冬瓜和金黃色葡萄球菌對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃處理，利用高通量測序技術(shù)研究小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化情況，旨在為通過飲食干預(yù)治療金黃色葡萄球菌感染性腸道疾病奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

4～5周齡ICR小鼠40只（20±2g），雌雄各半浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[動(dòng)物編號(hào)：1710300006，許可號(hào)：SCXK（浙）2014-0001]；冬瓜鹽胚、自然發(fā)酵的鹵水寧波三臭居公司，按固液1:1（w:v）比例混合，制成勻漿后保存在-80℃冰箱；金黃色葡萄球菌寧波大學(xué)海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室分離并保存；E.Z.N.A.StoolDNAKit試劑盒廣州飛揚(yáng)生物工程有限公司。NanohomogenizemachineAH100D型ATS高壓均質(zhì)機(jī)ATSEngineering公司；7890A/M7-80EI型氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品前處理

將選取成熟冬瓜，去皮除瓢，切成6～10cm大小的塊狀煮至七八分熟，鹽胚浸入臭鹵中，按1:1（w:v）比例混合，常溫密封發(fā)酵后，放入高壓均質(zhì)機(jī)中制成勻漿備用。金黃色葡萄球菌，在蛋白胨、牛肉膏培養(yǎng)基中37℃搖床過夜培養(yǎng)24h，稀釋成106CFU/mL懸液備用。

1.2.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

將實(shí)驗(yàn)小鼠按性別隨機(jī)分成4組，共8組，每組5只，標(biāo)記后稱重記錄初始體重。對(duì)照組（CT）每日灌胃生理鹽水（20g/kg/day），冬瓜組（SW）每日灌胃發(fā)酵冬瓜混合菌液（20g/kg/day），其中發(fā)酵冬瓜的灌胃量前期做了預(yù)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)對(duì)小鼠使用這個(gè)劑量能與感染金黃色葡萄球菌抗衡。金葡組（SA）每日灌胃金黃葡萄球菌液100μL，金葡+冬瓜處理組（SA+SW）每日灌胃金黃葡萄球菌液（10g/kg/day）和發(fā)酵冬瓜（10g/kg/day），連續(xù)給藥4周。每周測量體重。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程，小鼠自由攝食和飲水，控制室內(nèi)溫度（23±1℃）和濕度（55%±10%），循環(huán)12h光照/黑暗（燈光）。小鼠灌胃4周后收集糞便于-80℃冰箱備用。

1.2.3 高通量測序

1.2.3.1 模板的制備

將糞便樣品收集后立即置于液氮中冷凍，隨后儲(chǔ)存至-80℃冰箱中備用。利用QIAampDNAStoolMini提取試劑盒抽提糞便DNA，使用ThermoNanoDrop2000UV-Vis測定DNA濃度和純度。

1.2.3.2 16SrDNA測序

基因組樣品用DNAQubit2.0進(jìn)行精確定量后，對(duì)16SrRNA可變區(qū)（V3+V4）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，預(yù)變性98℃30s，35個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括：變性98℃10s，退火54℃30s，延伸72℃45s，最后延伸10min進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)束后，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物并切膠回收，精確定量后上機(jī)測序。樣品通過Illuminamiseq測序儀進(jìn)行2×300bp的雙端測序，并利用生物信息學(xué)進(jìn)行分析。

1.2.4 小鼠糞便短鏈脂肪酸含量測定

糞便干燥后稱取30±1mg，加入0.8mL的水，0.2mL50%的硫酸，1mL乙醚提取脂肪酸，并用氣-質(zhì)聯(lián)用儀測定。GC檢測條件：DB-WAX聚乙二醇毛細(xì)柱（60m×0.25mm×0.25μm），進(jìn)樣口溫度設(shè)為250℃，檢測溫度為250℃。升溫程序。MS檢測條件：離子源溫度為230℃，監(jiān)測方式為全掃描，EI電離，掃描的質(zhì)量范圍為45～450u，掃描的時(shí)間為46min，溶劑延遲時(shí)間為7min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS20.0軟件，采用單因素方差分析（onewayANOVA）比較各組間的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用ANOVA和Tukey'sposthoctest進(jìn)行分析，不符合方差分析特征的數(shù)據(jù)采用MannWhitneytest。*表示差異顯著，P＜0.05；**表示差異極顯著，P＜0.01；***表示極其顯著，P＜0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 腸道菌群的變化

2.1.1 菌群多樣性

如圖1和圖2所示，發(fā)酵冬瓜和金黃色葡萄球菌顯著（P＜0.05或P＜0.01）提高了雄性小鼠腸道菌群的多樣性和豐富度。而雌性小鼠只有喂食發(fā)酵冬瓜后腸道菌群的多樣性和豐度顯著提高(P＜0.01）。通過加權(quán)主坐標(biāo)分析（UniFracPCoA）發(fā)現(xiàn)喂食發(fā)酵冬瓜、金黃色葡萄球菌、金葡菌和發(fā)酵冬瓜的小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)與對(duì)照組小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)存在明顯差異。

相關(guān)鏈接：金黃色葡萄球菌，聚乙二醇，瓊脂糖，葉酸

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