蛋白質(zhì)和核酸是影響細(xì)胞結(jié)構(gòu)和遺傳信息的重要大分子，菌體細(xì)胞正常生長(zhǎng)情況下，蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)貫穿于整個(gè)胞膜和胞質(zhì)當(dāng)中，核酸、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)的外溢表明胞膜完整性遭到了破壞。菌懸液在260nm處的吸光度常用來(lái)判斷核酸的相對(duì)濃度。如圖4所示，0h時(shí)，各組間核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度均無(wú)明顯區(qū)別。隨時(shí)間增加，對(duì)照組核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度處于較低范圍且變化均較為平緩，而經(jīng)0.5MIC和1MIC的Fr5處理后，培養(yǎng)液中核酸的吸光度和可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度在2h迅速升高，與0h相比：核酸的吸光度分別增加了0.183、0.407，可溶性蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度分別增加了0.129g/L、0.187g/L。0h后，兩個(gè)處理組的核酸吸光度和可溶性蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度均始終高于對(duì)照組(P＜0.05)。對(duì)照組蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度有少量增加是因?yàn)椋弘S菌落數(shù)大幅增加，出現(xiàn)部分自然死亡細(xì)胞，釋放一定量蛋白質(zhì)。加入抑菌物質(zhì)后，S.aureus細(xì)胞膜遭破壞，DNA、RNA等大分子隨小分子相繼流出細(xì)胞，從而增加菌懸液核酸和蛋白質(zhì)的濃度。這說(shuō)明工業(yè)大麻葉提取物可導(dǎo)致菌體的膜功能障礙，細(xì)胞內(nèi)容物泄露，無(wú)法維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，從而達(dá)到抑菌作用。

2.3.4 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)菌體能量代謝的影響

ATP在細(xì)胞物質(zhì)運(yùn)輸、能量轉(zhuǎn)換中發(fā)揮重要作用。其濃度的變化直接關(guān)系到細(xì)胞的能量代謝。圖5反映了經(jīng)過(guò)不同濃度的Fr5處理后。S.aureus胞內(nèi)ATP濃度的變化：對(duì)照組樣品細(xì)胞內(nèi)ATP濃度隨時(shí)間增加呈上升趨勢(shì)，而經(jīng)0.5MIC和1MICFr5處理后，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度在2h顯著升高(P＜0.05)，隨后降低，在10h降低至26.175±3.336μmol/L和16.154±2.672μmol/L，較Oh分別降低了51.96％和70.35％。可能是抑菌物質(zhì)刺激了菌體，細(xì)胞為了維持正常生理功能出現(xiàn)應(yīng)激，ATP濃度在2h內(nèi)迅速上升。在4～10h，因電解質(zhì)損失。細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)子動(dòng)力降低，影響還原氫利用，ATP合成受抑制。另外，細(xì)胞內(nèi)ATP濃度降低也可能因?yàn)椋杭?xì)胞過(guò)度凋亡造成ATP合成速率降低和ATP的水解速率增加剛。其他抗菌藥物，如檸檬烯等也有類似現(xiàn)象俐。因此，工業(yè)大麻葉提取物會(huì)影響S.aureus的ATP合成或消耗，結(jié)合膜通透性變化，造成胞內(nèi)ATP濃度下降，從而抑制菌體代謝。

2.3.5 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)菌體氧化損傷的影響

菌體自由基能攻擊生物膜并引起細(xì)胞損傷，形成丙二醛等過(guò)氧化物。SOD是細(xì)胞中重要的保護(hù)酶，SOD特異性催化超氧陰離子，將其轉(zhuǎn)化為過(guò)氧化氫，CAT進(jìn)一步催化過(guò)氧化氫分解為水，它們協(xié)調(diào)工作，維持細(xì)胞內(nèi)活性氧的代謝平衡。由圖6可知，對(duì)照組SOD活力相對(duì)穩(wěn)定且維持在較低水平，說(shuō)明細(xì)胞膜未受到損傷。不同濃度工業(yè)大麻葉Fr5處理后的S.aureus胞內(nèi)SOD活力均呈先升高后降低的趨勢(shì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)0MIC、0.5MIC、1MIC細(xì)胞內(nèi)SOD活力分另0為0.203±0.014、0.180±0.023、0.132±0.011U，推測(cè)菌體在提取物的逆境脅迫下，前期SOD增加，清除有害物質(zhì)從而保護(hù)菌體免受毒害。但后期由于氧自由基的累積、膜脂過(guò)氧化的加重和蛋白質(zhì)變性導(dǎo)致保護(hù)酶水平的降低，使菌體自身防御能力下降。故推測(cè)：Fr5以劑量依賴的方式造成S.aureus的氧化損傷。

2.3.6 工業(yè)大麻葉Fr5餾分對(duì)細(xì)胞顯微特征的影響

用OMIC和1MIC濃度的Fr5分別處理細(xì)菌，掃描電鏡觀察S.aureus的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征變化。結(jié)果如圖7所示，對(duì)照組大部分S.aureus細(xì)胞呈球形，表面規(guī)則、光滑、外觀飽滿且結(jié)構(gòu)完整；然而，經(jīng)工業(yè)大麻葉1MIC提取物處理10h后，菌體表面出現(xiàn)皺縮，可見(jiàn)明顯破潰的菌體。這與細(xì)胞壁完整性、細(xì)胞膜通透性研究結(jié)果一致。細(xì)菌被抑制的原因可能是細(xì)胞膜被破壞.即使是膜結(jié)構(gòu)微小的變化也能極大影響細(xì)胞代謝并導(dǎo)致細(xì)胞死亡，其他研究也有類似結(jié)論。以上結(jié)果再次證明：工業(yè)大麻葉Fr5餾分可以使S.aureus膜結(jié)構(gòu)造成破壞。

3 結(jié)語(yǔ)

為了應(yīng)對(duì)過(guò)度使用化學(xué)防腐劑造成的健康風(fēng)險(xiǎn)和細(xì)菌耐藥性問(wèn)題，本研究探索了工業(yè)大麻葉對(duì)S.aureus的抑菌組成并對(duì)其機(jī)理進(jìn)行探索，證實(shí)了工業(yè)大麻葉Fr5餾分(V_石油醚:V_乙酸乙酯=1:1)可有效抑制S.aureus的生長(zhǎng)，MIC值為31.25μg/mL。經(jīng)GC-MS分析，共鑒定出24種化合物。由胞外AKP活力的升高、電導(dǎo)率的增加和細(xì)胞內(nèi)生物大分子(核酸和蛋白質(zhì))的滲漏以及掃描電鏡下菌體的微觀機(jī)構(gòu)變化，推測(cè)：工業(yè)大麻葉可能與陽(yáng)性對(duì)照氨芐青霉素鈉有相似的抑菌機(jī)制，均能破壞細(xì)菌細(xì)胞壁和細(xì)胞膜完整性。在食品加工過(guò)程中，控制微生物生長(zhǎng)的主要目標(biāo)是對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜的滅活處理。細(xì)菌細(xì)胞膜可保護(hù)細(xì)胞免受周?chē)h(huán)境傷害。并負(fù)責(zé)運(yùn)輸細(xì)胞生長(zhǎng)和代謝所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。當(dāng)細(xì)胞膜受損時(shí)。細(xì)菌的生長(zhǎng)和代謝就會(huì)被破壞。工業(yè)大麻葉Fr5作用于S.aureus后，可能是其中的化合物通過(guò)脂質(zhì)雙分子層疏水羥基的積累。作用于細(xì)胞膜或?qū)е录?xì)胞外膜脂多糖釋放，從而造成膜通透性和膜電位變化軔。維持正常膜電位是產(chǎn)生ATP維持細(xì)胞功能的前提。由于細(xì)胞膜的通透性增加，細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需的能量和關(guān)鍵物質(zhì)無(wú)法及時(shí)合成，影響菌體的能量代謝并造成氧化損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制。這些結(jié)果為工業(yè)大麻葉在食品保鮮方面的綜合利用和新型天然防腐劑的開(kāi)發(fā)提供了理論基礎(chǔ)，但抑菌物質(zhì)仍需進(jìn)一步分離、鑒定，并需要在分子水平上深入研究作用機(jī)制，尋找其具體靶點(diǎn)。

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