2-氯-6-（三氯甲基）吡啶（nitrapyrin，CP）是一種白色晶狀固體物質(zhì)。Goring報(bào)道了CP具有硝化抑制特性，CP施用到土壤后可顯著抑制硝化細(xì)菌的活性，延緩銨態(tài)氮向硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化，減少氮素的淋溶和溫室氣體排放，從而提高了氮素利用率，增加了作物產(chǎn)量。由于使用CP后，易被土壤吸附而降低其有效性，土壤對(duì)CP的吸附作用是影響其在土壤環(huán)境中有效性的重要因素，因此建立可同時(shí)測(cè)定不同類型土壤中CP含量的方法具有重要意義。

高效液相色譜法常用于土壤中有機(jī)物的定量分析，該方法成熟、準(zhǔn)確度較高.張玉敏等研究了甲基吡啶的高效液相色譜分析方法；王岙等通過(guò)液相色譜法同時(shí)測(cè)定兩種農(nóng)藥，解決了用氣相色譜法和質(zhì)譜法存在保存期短、處理步驟繁瑣及二者分離較難的問(wèn)題。目前多采用高效液相色譜法分析吡啶類物質(zhì)，利用反相色譜柱和極性流動(dòng)相，根據(jù)不同吡啶類物質(zhì)在反相柱的吸附力不同進(jìn)行分離，不需要高溫氣化，測(cè)定更易實(shí)現(xiàn)。土壤中有機(jī)物的提取方法主要包括索氏提取、超聲萃取和壓力萃取等，其中索氏提取法提取率較高，但存在耗時(shí)、有機(jī)溶劑消耗量大及操作復(fù)雜等缺點(diǎn)；壓力萃取需配備專用儀器，成本較高；超聲波提取操作簡(jiǎn)單、節(jié)能且省時(shí)省力。超聲萃取-高效液相色譜分析法操作簡(jiǎn)單，成本較低，由于CP化合物的極性為中性，沸點(diǎn)較低，其在土壤中的提取和含量測(cè)試方法目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此本文用超聲萃取-高效液相色譜法測(cè)定土壤中的CP，用AgilentSB-C18色譜柱，優(yōu)化流動(dòng)相最佳體積比和最佳流速，測(cè)定不同土壤類型中CP的質(zhì)量濃度。

一、材料與方法

1、儀器與試劑
高效液相色譜儀（安捷倫1260型，美國(guó)安捷倫公司）：六通閥進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器和色譜柱（AgilentSB-C18不銹鋼柱（4.6mm×150mm，5μm））；高速冷凍離心機(jī)（Z36HK型，德國(guó)HERMLE公司）；恒溫水浴振蕩器（SHA-C型，常州華普達(dá)儀器有限公司）。CP乳油（質(zhì)量分?jǐn)?shù)30%，實(shí)驗(yàn)室制備）；CP微囊懸浮劑（質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%，實(shí)驗(yàn)室制備）；甲醇、乙醇和乙腈（色譜純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；CP原藥（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司）；CP標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99.0%，德國(guó)LGCLabortG-mbH·Bgm公司）；實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水。

2、供試土壤

選擇草甸黑土、黑鈣土和風(fēng)沙土3種供試土壤.在吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站采集草甸黑土；在吉林省農(nóng)安縣農(nóng)田采集黑鈣土；在吉林省梨樹(shù)縣農(nóng)業(yè)科學(xué)試驗(yàn)站采集風(fēng)沙土。樣品采集地點(diǎn)均為連續(xù)多年種植玉米的土地，且無(wú)硝化抑制劑CP的使用記錄，土壤采樣深度為0～20cm，自然風(fēng)干，剔除動(dòng)植物殘?bào)w，過(guò)2mm篩，于密封袋中保存?zhèn)溆谩?種供試土壤的基本性質(zhì)列于表1。

3、方法

（1）流動(dòng)相條件：用高效液相色譜法測(cè)定氯化產(chǎn)物及產(chǎn)品中CP的質(zhì)量比。將流動(dòng)相設(shè)為：V（甲醇）：V（水）=9，V（甲醇）：V（水）=4，V（甲醇）：V（水）=7∶3；V（乙腈）：V（水）=9，V（乙腈）：V（水）=4，V（乙腈）：V（水）=7∶3。測(cè)定CP標(biāo)準(zhǔn)溶液（50mg/L）的色譜圖。

（2）檢測(cè)波長(zhǎng)用紫外檢測(cè)器在190～400nm內(nèi)對(duì)CP標(biāo)準(zhǔn)溶液（50mg/L）進(jìn)行紫外區(qū)光譜掃描。

（3）流動(dòng)相流速，用高效液相色譜法測(cè)定氯化產(chǎn)物及產(chǎn)品中CP的質(zhì)量濃度。考慮土壤浸提液中雜質(zhì)與CP的分離效果，將流動(dòng)相流速分別設(shè)為0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4mL/min，考察不同流速對(duì)CP色譜峰峰型和保留時(shí)間的影響。

（4）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作用分析純乙醇和CP標(biāo)準(zhǔn)品分別配制0，2，5，10，20，25，45，75mg/L的CP溶液，以CP質(zhì)量濃度和對(duì)應(yīng)峰面積繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4、測(cè)定方法評(píng)價(jià)指標(biāo)

（1）檢出限對(duì)空白土壤樣品連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定20次，根據(jù)峰面積計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，按計(jì)算檢出限。其中：D為檢出限；q為標(biāo)準(zhǔn)偏差；S為方法的靈敏度，即回歸線方程的斜率。

（2）準(zhǔn)確度和精密度

①在最佳測(cè)定條件下，對(duì)CP標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣10次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

②在3種土壤（CP無(wú)檢出）中分別添加低質(zhì)量濃度（25mg/L）和高質(zhì)量濃度（75mg/L）的CP標(biāo)準(zhǔn)溶液，m（固）∶V（液）=5，重復(fù)3次，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取1.50g于碘量瓶中，先分別用15，15，5mL分析純乙醇各超聲10min提取土壤中的CP，再于10000r/min離心，上清液用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆茫谧罴褱y(cè)定條件下測(cè)定不同類型土壤中CP的質(zhì)量比，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

③選擇CP乳油和CP微囊懸浮劑兩種劑型，分別稱取土壤10.00g，在土壤中分別添加2mL質(zhì)量濃度為50mg/L不同劑型的CP水溶液，充分混勻，重復(fù)3次，于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，取1.50g于碘量瓶中，先分別用15，15，5mL分析純乙醇各超聲10min提取土壤中的CP，再于10000r/min離心，上清液用0.45μm有機(jī)濾膜過(guò)濾，低溫（-20℃）保存?zhèn)溆?，在最佳測(cè)定條件下測(cè)定不同劑型中CP的質(zhì)量比，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)。

5、數(shù)據(jù)處理方法用SPSS17.0軟件處理數(shù)據(jù)，用單因素方差分析法分析差異顯著性（Duncan新復(fù)極差法，p＜0.05），用Oringe8.5軟件繪制圖表，通過(guò)色譜工作站（ChemStationEditionforLCandLC/MSsystems，C0.01.05）處理數(shù)據(jù)。

二、結(jié)果與討論

1、優(yōu)化CP測(cè)定條件

當(dāng)用色譜法分析吡啶類物質(zhì)時(shí)，選用C18色譜柱較多。由于高效液相色譜法測(cè)定吡啶類物質(zhì)時(shí)的色譜柱類型、流動(dòng)相、流速和檢測(cè)波長(zhǎng)等均顯著影響樣品的測(cè)定準(zhǔn)確度，因此本文研究不同流動(dòng)相及不同比例、流動(dòng)速度和檢測(cè)波長(zhǎng)等因素對(duì)CP質(zhì)量比測(cè)定的準(zhǔn)確度、精密度和檢測(cè)限的影響，并用超聲萃取法測(cè)定不同類型土壤中的CP質(zhì)量比。

（1）檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

當(dāng)溫度為25℃，V（乙腈）V（水）=4的溶液為流動(dòng)相，流速為0.8mL/min時(shí)，CP標(biāo)準(zhǔn)溶液（50mg/L）的紫外光譜如圖1所示。由圖1可見(jiàn)，在λ=285nm處有強(qiáng)吸收峰，為芳香環(huán)體系特征吸收峰，因此在該波長(zhǎng)處的檢測(cè)靈敏度較高，可作為CP的檢測(cè)波長(zhǎng)。

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