糖蛋白是廣泛存在于植物、動物和微生物機(jī)體內(nèi)必不可少的生物大分子，一般由多肽鏈和低聚糖鏈共價結(jié)合而成。糖鏈影響多肽鏈或蛋白質(zhì)的折疊形態(tài)和整體構(gòu)象。糖鏈與多肽鏈或蛋白質(zhì)連接的特殊結(jié)構(gòu)使糖蛋白有多種存在形式，從而具有多種生物活性。糖蛋白具有預(yù)防腫瘤，抗氧化，降膽固醇，提高機(jī)體免疫力等作用。糙米發(fā)芽過程的實(shí)質(zhì)是糙米活化。發(fā)芽使糙米內(nèi)部的多種酶被激發(fā)并且釋放，從結(jié)合狀態(tài)轉(zhuǎn)化為游離狀態(tài)，釋放出更多的營養(yǎng)物質(zhì)。發(fā)芽后的糙米不僅含原有的肌醇六磷酸鹽、膳食纖維、多種抗氧化物質(zhì)以及游離態(tài)微量元素和多種維生素，還含有新生成的營養(yǎng)物質(zhì)如γ-氨基丁酸等。其中蘊(yùn)含的營養(yǎng)成分和活性物質(zhì)顯著提高，食用和保健功能大幅度增加。有研究表明，糙米發(fā)芽后，其糖蛋白性能也有所改變，糖蛋白含量隨著萌發(fā)時間的延長而增加，且抗氧化性與萌發(fā)時間呈正相關(guān)。目前國內(nèi)外對GBRG的相關(guān)研究鮮有報道。

本試驗(yàn)采取超聲輔助提取GBRG，用DEAECellulose52陰離子交換層析法、SephadexG-200凝膠層析法分離純化，對純化的GBRG進(jìn)行抗炎和降血糖性能分析。為進(jìn)一步探尋消除炎癥，改善胰島素抵抗的天然藥物功能性食品提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品制備

供試粳稻為“龍粳”，用龔谷機(jī)去除稻子外殼得到糙米，按照文獻(xiàn)將糙米發(fā)芽并制備發(fā)芽糙米粗糖蛋白樣品，凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 試劑

DEAE-Cellulose52，日本Pharmacia集團(tuán)；脂多糖，北京索萊寶有限公司；硫酸、磷酸、乙酸、氯化鐵、碘化鉀、苯酚、硫酸銅、鄰二氮菲、鐵氰化鉀、鹽酸羥胺、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、吡啶、乙酸酐、鹽酸（分析純）等，南京生物化學(xué)試劑研究中心；α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷、阿卡波糖，上海和氏璧化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

680型酶標(biāo)儀，日本Bio-Rad集團(tuán)；CKX41型倒置顯微鏡，日本Olympus公司；Bj5060UV型CO2培養(yǎng)箱，美國Heraeus研究中心；DL-CJ-IN型超凈工作臺，南京醫(yī)療儀器制造中心；T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶、24孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，德國Corning公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)芽糙米粗糖蛋白的分離純化

分離純化流程GBRG粗品→上DEAE-Cellulose52陰離子柱→蒸餾水洗柱→氯化鈉洗柱→繪制梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、除鹽、濃縮、凍干→溶于蒸餾水→上SephadexG200瓊脂糖凝膠柱→氯化鈉洗柱→確定梯度洗脫曲線→洗脫峰透析、濃縮、凍干備用。

每一步獲得的GBRG均使用考馬斯亮藍(lán)法、苯酚-硫酸法檢測其多糖及蛋白質(zhì)含量。GBRG經(jīng)DEAE-Cellulose52陰離子交換層析和SephadexG200瓊脂糖凝膠柱層析，得到3個糖蛋白組分峰，分別命名為WEG、SEG-1和SEG-2。采用高效液相色譜、紅外光譜、圓二色性、1H-NMR譜等方法進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，證明3個GBRG組分峰具有顯著的糖蛋白特征。

1.3.2 GBRG的抗炎作用研究

1.3.2.1 細(xì)胞模型的建立

參照Xie等、Kim等的試驗(yàn)方法并加以調(diào)整，經(jīng)100ng/mLLPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞，建立細(xì)胞炎癥模型。

1.3.2.2 MTT法測定細(xì)胞增殖活性

選用96孔培養(yǎng)板，分為3組：空白、對照、樣品，3孔/組。將處于對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞配成濃度1×10⁵個/mL的細(xì)胞懸液，各孔添加100μL，進(jìn)行培育，過夜待用。各組分GBRG溶于細(xì)胞培養(yǎng)液，終濃度為濾膜微孔過濾，混入100μL濃度不一的含GBRG的培養(yǎng)液，再把培養(yǎng)板放于37℃、CO₂體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱中，連續(xù)孵育24h，混入200μL5mg/mLMTT溶液/孔，培育4h。使用1mL注射器收集各孔中的上清液，與100μLDM-SO混合，振動搖勻8min使結(jié)晶物全部溶解，570nm檢測細(xì)胞相對活力。

細(xì)胞相對活性=（樣品組-空白組）/（對照組空白組）×100%

1.3.2.3 RT-PCR測定細(xì)胞因子TNF-α、COX-2、IL-1β和iNOS的表達(dá)

（1）細(xì)胞分組

將RAW264.7細(xì)胞接于96孔板（5×10⁵個/mL），劃分成4組，培育過夜，各組包括3個重復(fù)孔。正常組：未加入LPS；LPS組：LPS質(zhì)量濃度是1μg/mL；WEG糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-1糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS；SEG-2糖蛋白組（50，100，200μg/mL）+1μg/mLLPS。先向細(xì)胞中添加各濃度糖蛋白，1h后加入LPS孵化24h。

（2）引物設(shè)計

按照IL-1β、β-actin、COX-2、iNOS與TNF-α的基因序列，由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計并合成。具體內(nèi)容如表1所示：

（3）RNA提取

選擇總RNA試劑盒用以提取RAW264.7細(xì)胞的總RNA，測定RNA濃度。

（4）逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的試劑為50ng～5μg總RNA、1μL引物Oligo（dT）₁₈（0.5μg/μL）、10μL2×ES反應(yīng)液、1μLRT/RI逆轉(zhuǎn)錄酶、1μLgDNA。將RNA模板、引物和DEPC水混合，65℃孵育5min后，冰浴2min，加入引物Oligo（dT）18，用于逆轉(zhuǎn)錄試驗(yàn)。42℃孵育15min，最后85℃孵育，使RT/RI與gDNA酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

（5）PCR擴(kuò)增

對逆轉(zhuǎn)錄所得到的cDNA進(jìn)行PCR。在PCR管中加入SYBRGreen染料5μL、上游引物0.3μL、下游引物0.3μL、待測cD-NA5μL、DEPC水2.4μL。低速離心30s，使管內(nèi)溶液完全混合，然后用RealtimePCR儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件為：94℃，5min預(yù)變性；65℃、2min，94℃、2min，共30個循環(huán)。

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相關(guān)鏈接：鄰苯三酚，鄰二氮菲，阿卡波糖，乙酸酐