2.2.2 發(fā)酵罐分批補料對芽孢率的影響

圖6顯示了枯草芽孢桿菌GX2的芽孢發(fā)酵曲線，同時給出了活菌數(shù)和芽孢率隨發(fā)酵時問的變化情況?？梢?，隨著發(fā)酵時問的延長，活菌和芽孢濃度和芽孢率均呈先增加后降低的變化趨勢，發(fā)酵至10h和11h時，活菌和芽孢濃度達最大，分別為1.1×10¹⁰，和7.2×10⁹CFu/mL，此時，芽孢率也達最大，為66.6％。此后，活菌數(shù)開始下降，芽孢數(shù)也相應降低，說明發(fā)酵過程進入衰亡期。在這個基礎上，發(fā)酵至9h時改變發(fā)酵條件，開展后續(xù)產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化研究。

2.3 發(fā)酵罐產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化

芽孢是產(chǎn)芽孢細菌在生長過程中形成的一種抗逆休眠體，因其具有耐熱、抗輻射、耐酸堿及抗化學藥物等特殊性質(zhì)，可有效抵抗外界環(huán)境條件的變化，提高存活率，優(yōu)化芽孢形成條件對微生物菌劑的制備具有一定的實踐價值。與菌體的生長繁殖相似，芽孢的形成同樣受營養(yǎng)物質(zhì)及環(huán)境條件等多因素的影響，在分批補料發(fā)酵培養(yǎng)提高細胞濃度的基礎上，對影響枯草芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的關鍵環(huán)境條件進行優(yōu)化，進一步提高芽孢數(shù)及芽孢率，可為提高好氧堆肥用微生物菌劑的品質(zhì)及其實際應用效果奠定技術(shù)基礎。

2.3.1 培養(yǎng)溫度對枯草芽孢桿菌CX2芽孢率的影響

培養(yǎng)溫度是影響微生物生長繁殖和芽孢形成的重要環(huán)境條件之一，它主要通過影響細胞內(nèi)生物大分子酶和蛋白質(zhì)的合成與活性來促進芽孢形成。作者在搖瓶實驗優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基條件下進行培養(yǎng)，并采用分批補料技術(shù)，使得細胞濃度在培養(yǎng)9h時達到最大，然后調(diào)整培養(yǎng)溫度，研究溫度對芽孢桿菌GX2芽孢率的影響，結(jié)果如圖7所示。可見，培養(yǎng)溫度可在一定程度上影響微生物的生長繁殖及芽孢的形成，隨溫度升高，活菌及芽孢濃度均呈大致增加的趨勢，而芽孢率先升高后降低。當培養(yǎng)溫度為35℃時，活菌和芽孢濃度均較低，分別為9.2×10⁹、5.5×10⁹CFU/mL，芽孢率為59.8％。此后，隨著培養(yǎng)溫度升高，活菌濃度和芽孢數(shù)逐步提高，50℃時，芽孢數(shù)和芽孢率均最大，分別為7.55×10，CFU/mL和70.6％。當溫度進一步升高至55℃時，盡管活菌數(shù)和芽孢數(shù)略有升高，但芽孢率開始下降，因此，后續(xù)產(chǎn)芽孢研究的培養(yǎng)溫度采用50℃。

2.3.2 攪拌轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌GX2芽孢率的影響

好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為好氧菌，氧氣是其生長繁殖和芽孢生成的重要影響因素。同時，溶解氧對發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性和生產(chǎn)成本也具有較大影響。發(fā)酵罐培養(yǎng)時，發(fā)酵液中的溶解氧與通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速有關，當通氣量一定時，可通過調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速改變發(fā)酵液中的溶解氧濃度，進而優(yōu)化發(fā)酵及產(chǎn)芽孢過程。攪拌轉(zhuǎn)速對枯草芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的影響如圖8所示?？梢姡S攪拌轉(zhuǎn)速的升高，活菌濃度不斷下降，而芽孢濃度和芽孢率卻呈先升高后降低的變化趨勢。由于發(fā)酵液中的細胞(活菌)濃度較高，約1.2×10¹⁰CFU/mL，較高的攪拌轉(zhuǎn)速帶來較大的剪切力，不利于細胞存活，因此，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高活菌數(shù)不斷下降，這與文獻報道一致。同時，隨攪拌轉(zhuǎn)速升高，較高的剪切力使得更多營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化為芽孢，當攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min時，芽孢濃度和芽孢率均最大，分別為9.7×10⁹CFU/mL和82.9％，進一步提高攪拌轉(zhuǎn)速，芽孢率開始下降，這與較高轉(zhuǎn)速下活菌數(shù)較低有關。

2.3.3 pH對枯草芽孢桿菌GX2芽孢率的影響

不同微生物菌株適宜的pH條件不同，酸堿度影響微生物細胞膜的通透性、膜結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及物質(zhì)的溶解性或電離性，致使微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用呈現(xiàn)差異，進而影響微生物的生長繁殖，并對芽孢桿菌的芽孢率產(chǎn)生影響。由圖9可知，隨DH升高，活菌數(shù)、芽孢數(shù)和芽孢率均呈先升高后降低的變化趨勢。當pH為6.8時，活菌濃度最大，為1.25×10¹⁰CFU/mL。當pH升高至7.3時，盡管活菌數(shù)開始降低，但芽孢濃度和芽孢率達最大，分別為9.7×10⁹CFU/mL和82.9％。進一步升高pH，活菌數(shù)、芽孢濃度以及芽孢率均明顯降低。

2.3.4 正交試驗優(yōu)化及驗證

正交試驗是考察關鍵影響因素綜合效應及進行多條件優(yōu)化的研究方法之一。這里，在單因素優(yōu)化的基礎上，以培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH為關鍵影響因素，選用正交表進3因素3水平的正交試驗研究，以活菌數(shù)和芽孢數(shù)為評價指標，研究關鍵影響因素對芽孢桿菌GX2產(chǎn)芽孢的綜合效應，因素水平設計如表1所示，實驗方案設計及結(jié)果如表2所示，正交試驗極差分析結(jié)果如表3所示。結(jié)果表明，3個影響因素對活菌數(shù)的影響主次順序為pH＞攪拌轉(zhuǎn)速＞培養(yǎng)溫度，由均值κ得出最優(yōu)組合為A₂B₂C₂，即pH為7.3，培養(yǎng)溫度為45℃，攪拌轉(zhuǎn)速為100r/min。從芽孢率角度，3個影響因素的主次順序與活菌數(shù)相似，但其最優(yōu)組合不同，為A₁B₃C₃，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min。

較高的活菌數(shù)是提高芽孢率的前提，因此，從優(yōu)化菌株生產(chǎn)性能，提高芽孢率的角度，選擇枯草芽孢桿菌GX2的活菌數(shù)和芽孢數(shù)均較高的培養(yǎng)條件和方案，確定最優(yōu)方案為A₁B₃C₃，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，在此條件下進行3L發(fā)酵罐試驗驗證，結(jié)果表明，活菌數(shù)可達1.57×10¹⁰CFU/mL，芽孢數(shù)達1.32×10¹⁰CFU/mL，芽孢率為84.1％。與單因素優(yōu)化相比，正交試驗優(yōu)化可進一步提高芽孢桿菌GX2的芽孢率，是其工業(yè)化生產(chǎn)應用的重要參考。

3 討論

好氧堆肥過程中添加微生物菌劑已成為促進堆肥腐熟、縮短堆肥周期的重要方法之一。微生物菌劑的作用效果與活菌數(shù)密切相關，隨著保存時間的延長，活菌數(shù)逐漸減少，影響堆肥效果。芽孢桿菌因其具有較強的抗逆性，能耐熱、酸、堿等不良環(huán)境，有利于微生物菌劑活性的保持，提高產(chǎn)品質(zhì)量及應用效果。Huo等通過研究多粘芽孢桿菌孢子和營養(yǎng)細胞在生物有機肥貯藏過程中的活性，發(fā)現(xiàn)純孢子可提高儲存期問的存活率和孢子形成。優(yōu)化芽孢桿菌的產(chǎn)芽孢條件，促進更多營養(yǎng)細胞轉(zhuǎn)化為芽孢。

培養(yǎng)條件優(yōu)化是產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化的重要前提。作者以實驗室保存的堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為研究對象，首先進行了搖瓶培養(yǎng)條件及培養(yǎng)基優(yōu)化，在此基礎上，采用分批補料策略在3L發(fā)酵罐上進行發(fā)酵培養(yǎng)，所得發(fā)酵液的0D值和營養(yǎng)細胞濃度可達2.250和1.8×10¹⁰CFU/mL。汪晶晶等通過對淀粉芽孢桿菌的培養(yǎng)基及條件優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)菌體生長量有明顯提高，A_600nm由1.228增加至1.6727。

目前，關于芽孢桿菌芽孢率的優(yōu)化研究多是在搖床上完成的，郭曉軍等對堆肥用產(chǎn)蛋白酶的產(chǎn)芽孢條件進行了優(yōu)化，芽孢率達95％。劉虎軍等對枯草芽孢桿菌進行了DH和溫度的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，生物量和芽孢數(shù)分別為5.7×10¹⁰、5.2×10¹⁰CFU/mL，芽孢率達91％。為實現(xiàn)工業(yè)化應用，發(fā)酵罐規(guī)模的產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化更具參考價值，為此，作者在搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎上，結(jié)合分批補料發(fā)酵技術(shù)，在3L發(fā)酵罐上進行了產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，經(jīng)單因素及正交試驗研究，獲得了堆肥用枯草芽孢桿菌CX2的最佳產(chǎn)芽孢條件，即pH為6.8，培養(yǎng)溫度為50℃，攪拌轉(zhuǎn)速為150r/min，此時，芽孢濃度為1.32×10¹⁰CFU/mL，芽孢率為84.1％，研究結(jié)果可為芽孢桿菌在微生物菌劑中的工業(yè)化應用提供重要參考。

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