人乳的蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度與動(dòng)物源乳制品有較大差異(見(jiàn)表1)，這使得免疫系統(tǒng)容易將非人源的蛋白質(zhì)判定為過(guò)敏原因子，并引起一系列超敏反應(yīng)。酪蛋白作為牛乳蛋白質(zhì)的主要成分大約占總蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80％，其中許多組分并不存在于母乳之中，如α_s1酪蛋白、α_s2酪蛋白和γ酪蛋白，這些組分很難被人體內(nèi)蛋白酶消化水解，并可能以完整的結(jié)構(gòu)進(jìn)入人體血液中引起過(guò)敏反應(yīng)。目前普遍認(rèn)為αs1酪蛋白是主要的過(guò)敏原，從表1也可以看出，α_s1酪蛋白是人乳和牛乳中差別最大的蛋白質(zhì)。

α_s1酪蛋白作為過(guò)敏原極難被降解的原因在于乳制品中酪蛋白相互之問(wèn)極易形成酪蛋白膠粒，一般南α_s1酪蛋白、α_s2酪蛋白、β酪蛋白和κ酪蛋白組成，這些多為分散的、大的、近似球形的膠體粒子，直徑一般在50～600nm之間。有研究表明，酪蛋白膠粒中β酪蛋白和κ(酪蛋白可形成大量分子問(wèn)二硫鍵，而巴氏滅菌的高溫可使得這些二硫鍵更為復(fù)雜，這使得膠粒更難被蛋白酶降解。

一般破壞二硫鍵需要合適的堿性環(huán)境和二硫還原酶或與二硫還原酶功能相似的化學(xué)還原劑。二硫還原酶包括烷基過(guò)氧化氫還原酶、硫氧還原蛋白還原酶川和二氫硫辛酸脫氫酶等；化學(xué)還原劑包括口β-巰基乙醇、巰乙酸和二硫蘇糖醇等。此外在生物水解中，許多角蛋白分解菌可生成亞硫酸鹽破壞角蛋白酶中的二硫鍵，從而輔助水解過(guò)程的進(jìn)行。

過(guò)氧化氫酶主要存在于細(xì)胞及組織內(nèi)的過(guò)氧化體中，參與許多重要反應(yīng)，是生物體維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵酶，也被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)，如維持還原環(huán)境防止食物被氧化。枯草芽孢桿菌中的植物過(guò)氧化氫酶是為數(shù)不多的胞外分泌型過(guò)氧化氫還原酶，可以催化過(guò)氧化氫分解成氧和水。David等的研究表明，其主要功能為協(xié)助細(xì)胞及細(xì)胞分泌的胞外酶對(duì)抗環(huán)境中的氧化應(yīng)激。本研究中結(jié)合ELISA和質(zhì)譜鑒定，比對(duì)兩株種屬相同的野生菌發(fā)酵液酶活，以及胞外酶的差異，發(fā)現(xiàn)了枯草芽孢桿菌植物過(guò)氧化氫酶除已報(bào)道功能外，還具有破壞酪蛋白膠粒的二硫鍵，協(xié)助蛋白酶高效水解過(guò)敏原α_s1酪蛋白。此外，我們還將過(guò)氧化氫酶與蛋白酶混合水解脫脂奶粉，使用HPLC和LC-MS/MS分析了水解產(chǎn)物的口感和所生成的功能性多肽，為未來(lái)使用混合酶制劑制備脫敏奶制品提供一定理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種與載體

E.coliDH5α和E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞：生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；枯草芽孢桿菌S7(菌種保藏編號(hào)CCTCCN0.M2016532)：中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心；原核表達(dá)載體pET-24a(+)：Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑

細(xì)菌小量質(zhì)粒提取試劑盒、細(xì)菌基因組提取試劑盒、卡那霉素和TaqDNA聚合酶：生工生物工程(上海)股份有限公司產(chǎn)品；PrimerSTARDNA聚合酶、SYBRPremixExTaqKit和DNA連接酶：大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；Humancaseinalphas1(CSNlSl)ELISA試劑盒：武漢華美生物工程有限公司產(chǎn)品；NuPAGEBis-Tris蛋白質(zhì)預(yù)制膠和脫脂奶粉：賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司產(chǎn)品；其余試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

高通量全自動(dòng)菌種篩選及蛋白質(zhì)結(jié)晶工作站(移液工作站)：瑞士帝肯公司產(chǎn)品：MALDI-TOF/T0F基質(zhì)輔助激光解析電離串聯(lián)飛行時(shí)問(wèn)質(zhì)譜儀：美國(guó)布魯克·道爾頓公司產(chǎn)品；游離氨基酸分析專(zhuān)用高效液相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司產(chǎn)品；QExactivePlus混合四極軌道質(zhì)譜儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 目標(biāo)菌的高通量篩選

將從奶牛牧場(chǎng)收集到的土樣處理后，初步獲得3000株野生菌，使用高通量全自動(dòng)菌種篩選工作站將野生菌轉(zhuǎn)移至篩選平板(200g/L馬鈴薯煮爛后經(jīng)6層紗布過(guò)濾獲得的濾過(guò)液，20g/L葡萄糖，15g/L脫脂奶粉，15g/L瓊脂粉)，挑選產(chǎn)生水解圈的野生菌劃線轉(zhuǎn)移至新的平板(見(jiàn)圖1)。

1.2.2 針對(duì)底物αs1酪蛋白選擇性的ELISA分析

將各野生菌編號(hào)并轉(zhuǎn)移至PDA液體培養(yǎng)基(200g/L馬鈴薯煮爛后經(jīng)6層紗布過(guò)濾獲得的濾過(guò)液，20g/L葡萄糖)中，30℃恒溫培養(yǎng)至指數(shù)生長(zhǎng)期，取發(fā)酵液上清液測(cè)定酶活進(jìn)行復(fù)篩鑒定。先通過(guò)0PA法測(cè)定針對(duì)脫脂奶粉的酶活，再逐步稀釋各個(gè)野生菌發(fā)酵液上清液，使其針對(duì)脫脂奶粉的酶活達(dá)到同一水平，以減少發(fā)酵液復(fù)雜成分帶來(lái)的影響，此后繼續(xù)以脫脂奶粉作為底物重復(fù)相同的水解過(guò)程，但使用針對(duì)α_s1酪蛋白的ELISA試劑盒檢測(cè)各個(gè)發(fā)酵液上清液對(duì)于特定過(guò)敏原的酶活，以確定各個(gè)野生菌對(duì)于過(guò)敏原的選擇性高低。

1.2.3 發(fā)酵液上清液蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜分析

將各個(gè)野生菌發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE分析，對(duì)不同相對(duì)分子質(zhì)量大小的膠條進(jìn)行預(yù)處理后，與胰蛋白酶混合，37℃酶解過(guò)夜，處理后點(diǎn)靶進(jìn)行質(zhì)譜分析，質(zhì)譜結(jié)果與mascot數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行肽段比對(duì)鑒定。

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