好氧堆肥化是有機(jī)固體廢棄物減量化、無(wú)害化及資源化的有效途徑之一，是在微生物作用下通過(guò)高溫發(fā)酵使有機(jī)物變成腐熟肥料的過(guò)程。好氧堆肥不僅含有大量可被植物吸收利用的有效態(tài)氮、磷、鉀及其化合物，而且含有構(gòu)成土壤肥力的重要活性物質(zhì)腐殖質(zhì)，既解決了有機(jī)同體廢棄物的環(huán)境污染問(wèn)題，又起到改良土壤和增加肥效的作用。在好氧堆肥過(guò)程中添加外源微生物菌劑可有效提高堆體中功能微生物的數(shù)量，加快有機(jī)物轉(zhuǎn)化及堆肥進(jìn)程，提高肥效。Xi等通過(guò)接種復(fù)合菌劑增加堆肥過(guò)程中細(xì)菌的多樣性，可有效提高堆肥效率。Zhao等發(fā)現(xiàn)在堆肥過(guò)程中接種放線菌可顯著提高纖維素酶活性，加速纖維素降解，提高腐殖質(zhì)含量，減少溫室氣體排放。微生物菌劑的應(yīng)用效果與活菌數(shù)密切相關(guān)，有效活菌數(shù)是衡量微生物菌劑品質(zhì)的重要指標(biāo)，然而，隨著微生物菌劑保存時(shí)間的延長(zhǎng)，活菌數(shù)不斷減少，降低菌劑的使用效果，同時(shí)，微生物菌劑的制備成本較高，影響了其工業(yè)化應(yīng)用。

芽孢桿菌具有較強(qiáng)的抗逆性，能耐熱、酸和堿等不良環(huán)境，可有效保持菌劑中的微生物活性，提高菌劑質(zhì)量及應(yīng)用效果王雪蓮等采用響應(yīng)面法對(duì)影響枯草芽孢桿菌B579的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，為進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度和后續(xù)放大培養(yǎng)提供參考，同時(shí)，對(duì)其產(chǎn)芽孢條件進(jìn)行了優(yōu)化。王法國(guó)等通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法對(duì)解淀粉芽孢桿菌JT84的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，所得發(fā)酵液的芽孢含量為1.67×109CFU/mL，與基礎(chǔ)培養(yǎng)基相比，提高了159％。郭曉軍等通過(guò)對(duì)堆肥用產(chǎn)蛋白酶菌株的單因素、正交試驗(yàn)產(chǎn)芽孢條件優(yōu)化，芽孢產(chǎn)率達(dá)95.0％，為解決以芽孢桿菌為主的微生物菌劑產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)過(guò)程中存在的活性低等問(wèn)題提供了重要參考。

作者采集污泥與秸稈混合好氧堆肥樣品，進(jìn)行微生物初篩、復(fù)篩及分離純化，分子鑒定后獲得一株用于好氧堆肥的枯草芽孢桿菌GX2，具有耐高溫、耐酸等特點(diǎn)，將其應(yīng)用于堆肥過(guò)程能有效縮短堆肥周期，提高堆肥品質(zhì)。針對(duì)上述枯草芽孢桿菌GX2，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化，在3L發(fā)酵罐中通過(guò)分批補(bǔ)料技術(shù)進(jìn)一步提高細(xì)胞濃度，并通過(guò)單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化產(chǎn)芽孢工藝條件，可為降低其發(fā)酵及菌劑制備成本提供有益參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

堆肥用菌株：好氧堆肥用枯草芽孢桿菌GX2為實(shí)驗(yàn)室保存菌株；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化鈉5g/L，pH為7.2±0.2；計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化鈉5g/L，瓊脂15g/L，pH為7.0～7.2；搖瓶及3L發(fā)酵罐的基礎(chǔ)培養(yǎng)基：酪蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，NaCl5g/L，pH7.3，消泡劑0.2％(體積分?jǐn)?shù))；補(bǔ)料培養(yǎng)基：50g/L的蔗糖溶液；營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨、牛肉浸膏、硫酸錳、蔗糖和硝酸鈉：上海國(guó)藥集團(tuán)產(chǎn)品。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化及種子液制備

將4℃冰箱內(nèi)保藏的菌株接入已滅菌的液體肉湯培養(yǎng)基中，搖床上45℃、160r/min活化12h后，在同體營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上三區(qū)平板劃線，置于45℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，挑選三區(qū)單菌落傳代兩次后，作為發(fā)酵菌株使用。

挑取已活化的發(fā)酵菌株單菌落，接種于裝有100mL已滅菌的肉湯培養(yǎng)基250mL三角瓶中，置于搖床振蕩培養(yǎng)，在溫度為45℃，轉(zhuǎn)速為160r/min培養(yǎng)12h作為種子液。

1.2.2 搖瓶培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件優(yōu)化

在搖床發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，以0D值為指標(biāo)，對(duì)菌株GX2進(jìn)行碳源種類(葡萄糖、蔗糖、淀粉)、最佳碳源質(zhì)量濃度(5、10、20、30、40g/L)、氮源種類(酵母粉、氯化銨、硝酸鈉)、最佳氮源質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25g/L)、裝液量(50、100、150、200mL)的單因素優(yōu)化。搖床培養(yǎng)的初始條件為溫度45℃，轉(zhuǎn)速160r/min,裝液量100mL(250mL)，pH7.3。實(shí)驗(yàn)在同一時(shí)問(wèn)取樣測(cè)定0D值來(lái)優(yōu)化培養(yǎng)基及其培養(yǎng)條件,優(yōu)化后的培養(yǎng)基用于發(fā)酵罐培養(yǎng)。每組試驗(yàn)3次重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1.2.3 發(fā)酵罐分批補(bǔ)料培養(yǎng)

發(fā)酵罐型號(hào)為B10TECH-3JG-3JG-9000D，上海保光公司產(chǎn)品。在前期搖床培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將發(fā)酵罐初始條件設(shè)置為工作體積1.5L、壓力0.05MPa、攪拌轉(zhuǎn)速300r/min、溫度45℃、接種量為1×107CFU/mL，通過(guò)流加3mol/L的Na0H和HCl將DH值自動(dòng)控制在7.3。將3L發(fā)酵罐進(jìn)行滅菌，然后裝入1.5L發(fā)酵培養(yǎng)基于121℃滅菌30min，取出后將溫度、pH、轉(zhuǎn)速、溶氧設(shè)置在初始條件，以1×10⁷CFU/mL的接入量接種新鮮活化的GX2種子液。

分批發(fā)酵是在上述條件下上罐進(jìn)行菌株發(fā)酵，測(cè)定發(fā)酵過(guò)程中0D值、殘?zhí)菨舛?、活菌?shù)，獲得菌株在發(fā)酵罐上的補(bǔ)料時(shí)間和補(bǔ)料量。分批補(bǔ)料發(fā)酵是在分批發(fā)酵的基礎(chǔ)上，當(dāng)總糖量消耗一半時(shí),加入碳源至原濃度，繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞濃度達(dá)到穩(wěn)定時(shí)停止補(bǔ)料發(fā)酵。以最大0D值和最大活細(xì)胞數(shù)作為參考值，來(lái)分析分批發(fā)酵和分批補(bǔ)料發(fā)酵的效果。

在分批補(bǔ)料發(fā)酵的基礎(chǔ)上，取樣測(cè)定活菌數(shù)和芽孢數(shù)，繪制芽孢曲線圖。在產(chǎn)芽孢時(shí)開始控制條件來(lái)優(yōu)化芽孢率，并在芽孢率最大時(shí)取樣測(cè)定。

1.2.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)條件優(yōu)化

1)單因素優(yōu)化芽孢率在發(fā)酵罐分批補(bǔ)料優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別研究培養(yǎng)溫度、攪拌轉(zhuǎn)速和pH值對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的影響。

2)正交試驗(yàn)優(yōu)化芽孢率根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到的pH(4)，溫度(B)、轉(zhuǎn)速(C)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)3因素3水平正交試驗(yàn)，并根據(jù)正交試驗(yàn)數(shù)據(jù)的極差分析，得到菌株產(chǎn)芽孢的最佳發(fā)酵條件。

3)追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)根據(jù)正交試驗(yàn)分析的最佳發(fā)酵培養(yǎng)條件，進(jìn)行追加驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

1.3 分析測(cè)試項(xiàng)目與方法

細(xì)胞濃度：采用比色法，以空白培養(yǎng)基作參比.在600nm處測(cè)定發(fā)酵液0D值?；罴?xì)胞數(shù)：采用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，發(fā)酵液進(jìn)行10倍稀釋后，涂布平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

芽孢數(shù)：將發(fā)酵液在70℃下處理15min后。冷卻，采用稀釋梯度平皿計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)。

芽孢率：芽孢數(shù)占活菌數(shù)的百分?jǐn)?shù)。

總糖含量：采用3，5-二硝基水楊酸(DNS)比色法。

2 結(jié)果與分析

2.1 搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

2.1.1 生長(zhǎng)曲線繪制

微生物菌株生長(zhǎng)一般經(jīng)歷延滯期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個(gè)階段。首先是菌體生長(zhǎng)的遲滯期，生長(zhǎng)緩慢，細(xì)胞濃度基本不會(huì)增加；適應(yīng)新環(huán)境后，微生物生長(zhǎng)繁殖速度加快，細(xì)胞濃度快速提高，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期：此后，隨著底物不斷被消耗，細(xì)胞濃度進(jìn)入穩(wěn)定期：底物進(jìn)一步消耗殆盡，微生物生長(zhǎng)進(jìn)入衰產(chǎn)期，細(xì)胞濃度明顯下降。繪制微生物菌株的生長(zhǎng)曲線可為其培養(yǎng)條件優(yōu)化提供重要參考，圖1給出了枯草芽孢桿菌GX2的發(fā)酵液0D值隨培養(yǎng)時(shí)問(wèn)的變化情況。

由圖1可知，細(xì)胞濃度在前期有短暫的生長(zhǎng)停滯期，之后發(fā)酵液在波長(zhǎng)600nm處的吸光度呈直線上升趨勢(shì)，至14h時(shí)，細(xì)胞濃度達(dá)到最大，A_600nm為1.698，之后開始下降。通常情況下，處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌株活力最強(qiáng)，細(xì)胞濃度也最高，因此，確定14h為枯草芽孢桿菌GX2的最佳培養(yǎng)時(shí)間，并用作后續(xù)搖瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化研究的發(fā)酵終止時(shí)問(wèn)。

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