真菌毒素是真菌的次生代謝產(chǎn)物，真菌在一定條件下生長極其迅速，不同菌種產(chǎn)生不同類型的毒素。種類繁多，可導(dǎo)致人和動物急慢性中毒，對人體及動物的健康危害極大。糧食作物在收割過程中因刮傷或儲存條件不當(dāng)，而使真菌毒素迅速累積，造成毒素污染，其污染范圍難以控制，危害難以防控。

黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、雜色曲霉素等是食用油中經(jīng)常出現(xiàn)的毒素種類。其中，黃曲霉毒素被世界衛(wèi)生組織列為“I類致癌物”，其具有親肝性，可誘發(fā)肝炎、肝硬化、甚至肝癌等惡性疾病，危害極大。北京等地區(qū)食用油樣品的隨機(jī)抽取結(jié)果顯示：黃曲霉毒素和玉米赤霉烯酮均有較高的檢出率。為保障公眾健康，世界各國均對植物油脂中的部分真菌毒素含量制定了相關(guān)規(guī)定。我國僅對食用植物油中的黃曲霉毒素B1進(jìn)行了限量(見GB2761-2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中真菌毒素限量》)，規(guī)定要求：食用油中黃曲霉毒素B₁含量不得超過10μg/kg，其中花生油和玉米油不得超過20μg/kg。

目前，真菌毒素的檢測手段主要有高效液相色譜法(HPLC)、酶聯(lián)免疫法以及液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)。其中，酶聯(lián)免疫法具有簡單、快速的優(yōu)點(diǎn)，多用于單一真菌毒素的快速篩查。其檢測結(jié)果容易受到基質(zhì)中的油脂干擾，假陽性高，需要通過其它手段對陽性樣品進(jìn)行確證舊。高效液相色譜法結(jié)合熒光檢測器或串聯(lián)質(zhì)譜儀是目前主要的真菌毒素檢測方法，具有穩(wěn)定性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)，其前處理多數(shù)需要分別配合免疫親和柱/多功能凈化柱使用。免疫親和凈化柱是利用抗原抗體的特異性結(jié)合達(dá)到去除基質(zhì)中干擾物質(zhì)的目的，其專一性和選擇性較強(qiáng)。然而，鍵合一種抗體的免疫親和凈化柱只能對單一目標(biāo)物進(jìn)行凈化，若應(yīng)用于多毒素篩查則需要對填料進(jìn)行復(fù)配，檢測成本昂貴。多功能凈化柱可應(yīng)用于多種毒素的篩查，然而多數(shù)多功能凈化柱用離子交換填料，會吸附食用油中潛在赭曲霉毒素和伏馬毒素等酸性化合物，因此不適合多類真菌毒素的同時(shí)篩查。

基于此，本研究通過優(yōu)化提取方法以及優(yōu)選多功能凈化柱，以實(shí)現(xiàn)高效快速的樣品前處理，再結(jié)合液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對食用植物油中黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮和伏馬毒素等28種真菌毒素進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

甲醇、乙腈(色譜純級)，美國Sigma公司；甲酸(色譜純級)，霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司；甲酸(98％)，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液、黃曲霉毒素M₁、HT-2毒素、T-2毒素、赭曲霉毒素A、伏馬毒素B₁、伏馬毒素B₂、伏馬毒素B₃、嘔吐毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液[包括：脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、3-乙酰基脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、15-乙?；撗跹└牭毒┐?、雪腐鐮刀菌烯醇、3-葡萄糖苷化-脫氧雪腐鐮刀菌烯醇]，均購自ROMER國際貿(mào)易有限公司；渥曼青霉素、赭曲霉毒素B、黃曲霉毒素M₂，均購自北京振翔科技有限公司；新茄病鐮刀菌烯醇、蛇形毒素、雜色曲霉素、玉米赤霉烯酮、α-玉米赤霉烯醇β-玉米赤霉烯醇、玉米赤霉酮、α-玉米赤霉醇、α-玉米赤霉烯醇，均購自上海安譜科技實(shí)驗(yàn)股份有限公司。

LC-30AD高效液相色譜儀，日本島津公司；QTRAP5500三重四級桿質(zhì)譜儀，美國ABSciex公司；Allegra64R臺式高速離心機(jī)，美國貝克曼公司：TTL-DCⅡ型氮吹儀，北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司；MilliQ超純水機(jī)，美國Millipore公司；CaptivalEMR-Lipid固相萃取凈化柱，美國安捷倫公司；QL902渦旋振蕩器，德國DragonLab公司：SB-3200DTDN超聲波清洗器，寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 前處理方法

準(zhǔn)確稱取2.5g食用油樣品(精確至0.01g)于15mL離心管中，加入5mL乙腈/水/甲酸提取液(V_乙腈:V_水:V_甲酸=80:18：2)，渦旋振蕩1min，超聲提取20min，-20℃冷凍10min，5000r/min離心10min，取上層清液全部轉(zhuǎn)移至一潔凈試管；向樣品試管中加入5mL乙腈/水/甲酸提取液(V_乙睛:V_水:V_甲酸=20:78:2)，同上述步驟進(jìn)行提取，合并2次提取液并混勻，待凈化。

取5mL混合提取液加入CaptivaEMR-Lipid凈化柱，加正壓使提取液流經(jīng)凈化柱速度為3s/d，待提取液全部流出后，加2mL乙腈/水(V_乙腈:V_水=80:20)溶液沖洗，收集全部凈化后的提取液，在50℃水浴下，氮?dú)獯蹈?，加?50μL甲醇/水/甲酸溶液(V甲醇:V_水:V_甲酸=30:70:O.1)復(fù)溶，12000r/min離心10min，取上層清液待測。

1.3 儀器條件

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Shiseido-C18(100mm×2.0mm，3μm)；進(jìn)樣量20μL；流速0.3mL，min；流動相：A相為0.1％甲酸/水溶液，B相為0.1％甲酸/甲醇溶液；正模式洗脫梯度：0～1min30％B，6.5min55％B，8.5min55％B，10min80％B，12min80％B，12.01min30％B，16min30％B；負(fù)模式洗脫梯度為：0min3％B，2min55％B，9min70％B，10min99％B，11min99％B，11.1min3％B，15min3％B。

1.3.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)，離子源溫度550℃；噴霧電壓5500V(正模式)/-4500V(負(fù)模式)；氣簾氣2.4×105Pa；氣體13.8×105Pa；氣體23.8×105Pa；采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式進(jìn)行檢測，質(zhì)譜參數(shù)見表1。

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