2.3 圓二色譜(CD)

通常，膠原在CD光譜圖中會(huì)表現(xiàn)出典型的三股螺旋結(jié)構(gòu)的分子特征，即在220～230nm和200nm處分別出現(xiàn)正吸收峰和負(fù)吸收峰。由圖2可見，超聲輔助酶提明膠在201nm波長(zhǎng)處存在負(fù)吸收峰，在223nm波長(zhǎng)出現(xiàn)了一定程度的正吸收峰。220～230nm波段的正值吸收對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)α-螺旋，胃蛋白酶切斷膠原分子的N及C端的非膠原性肽，對(duì)膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)無明顯影響，但會(huì)導(dǎo)致儀鏈的降解，導(dǎo)致正吸收峰不明顯。有研究表明，負(fù)峰強(qiáng)度越大，無規(guī)則卷曲程度越大，圖2中胃蛋白酶提取的明膠的負(fù)峰強(qiáng)度明顯小于常規(guī)熱水提取的明膠，膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)較為完好，與鄭雅爻等的測(cè)試結(jié)果相符。利用胃蛋白酶提取的明膠形成類膠原三股螺旋結(jié)構(gòu)，天然膠原的儀一螺旋部分解鏈，但仍維持著膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)，說明超聲輔助酶提明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)更加有序。

2.4 SDS-PAGE分析

采用SDS-PAGE檢測(cè)明膠樣品的亞基組成與相對(duì)分子質(zhì)量分布，明膠分子包含α1、α2、β這3條鏈，相對(duì)分子質(zhì)量在130000～250000之間。雞肺膠原轉(zhuǎn)變?yōu)槊髂z的過程涉及次級(jí)鍵的斷裂，隨機(jī)斷裂的鍵造成了膠原水解產(chǎn)物組分的多樣化，明膠分子既可能是單鏈，也可能是α鏈片段的共價(jià)交聯(lián)體。如圖3，電泳條帶2顯示，常規(guī)熱水提取的雞肺明膠組分包括αl、α2鏈，以及不清晰的小分子片段，與李越在SDS-PAGE圖譜中觀察到的市售明膠類似。雞肺胃蛋白酶提取的明膠電泳條帶1沒有明顯的α1、α2、β這3條鏈對(duì)應(yīng)的電泳條帶中出現(xiàn)45000～95000之間的一些占絕大部分的蛋白降解條帶，沒有明顯的α1、α2、β這3條鏈對(duì)應(yīng)的電泳條帶。在酸性條件下用胃蛋白酶處理可切斷膠原分子N及C端的非膠原性肽，導(dǎo)致α、α2鏈的展開。超聲波可以對(duì)雞肺膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)造成輕微降解，氫鍵的斷裂使得肽鏈變得松散，利于后期酸性pH條件下的酶處理。隨著酶解時(shí)問的延長(zhǎng)，加熱過程中膠原的肽端受到破壞，分子問的共價(jià)鍵斷裂，高分子組分更容易降解，明膠分子游離出來。孫藝等在提取大目金槍魚皮明膠中的發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性蛋白酶的存在使明膠降解為小分子，電泳條帶1中出現(xiàn)了低于45000的幾條模糊的小分子蛋白條帶，可能是由于進(jìn)一步的酶解，明膠斷裂為更小的分子。也可能是在酸性條件下浸提使明膠發(fā)生了熱降解，溶脹的膠原由于其疏松的結(jié)構(gòu)在熱水提取時(shí)更容易降解。

2.5 紫外吸收光譜圖

明膠中由于存在C=0、CONH₂、-C00H等發(fā)色基團(tuán)，紫外特征吸收峰通常出現(xiàn)在220nm波長(zhǎng)左右，結(jié)果見圖4。與圖中曲線吸收峰(229nm)吻合，證明明膠肽鏈分子中存在酰胺鍵，雞肺明膠溶液的紫外吸收光譜與Chandra等的結(jié)果類似。大多數(shù)蛋白質(zhì)中存在的一些芳香族氨基酸殘基在波長(zhǎng)270～280nm處存在紫外吸收峰，在一般經(jīng)純化的明膠中不會(huì)出現(xiàn)，超聲輔助酶提明膠與常規(guī)熱水提取的明膠在280nm處有微量吸收，說明明膠樣品中只含有少量芳香族氨基酸，可以初步判斷試驗(yàn)提取的雞肺明膠具有較高的純度。超聲輔助酶提明膠的雜峰較常規(guī)熱水提取的明膠雜峰更明顯。

2.6 粒徑分布

由圖5可知，超聲輔助胃蛋白酶提取的明膠平均粒徑為396nm，小于常規(guī)熱水提取。超聲波處理會(huì)改變明膠的二級(jí)結(jié)構(gòu)，Yu等的研究表明超聲波處理過的明膠，其平均粒徑顯著下降?？赡苁怯捎诔暡ǖ奈锢硇?yīng)對(duì)分子問靜電作用的破壞以及氣穴效應(yīng)產(chǎn)生的強(qiáng)剪切力，使得后續(xù)酶解過程中膠原的三螺旋結(jié)構(gòu)解鏈程度較高，分子間的交聯(lián)鍵斷裂更為徹底，大分子蛋白進(jìn)一步降解得到明膠亞基，與SDS-PAGE分析所得結(jié)果一致。

2.7 掃描電鏡(SEM)

雞肺明膠的微觀結(jié)構(gòu)利用SEM觀察，與常規(guī)熱水提取的雞肺明膠(圖6(b))相比，經(jīng)過超聲輔助酶提取的明膠化膠原(圖6(a))，表面有較大程度的破碎，甚至出現(xiàn)較多的孔洞，這一變化與陳書霖等研究的不同酸預(yù)處理下鰱魚皮明膠的表觀類似。在酸性條件下膠原分子問的排斥力會(huì)增強(qiáng)，結(jié)果導(dǎo)致膠原在乙酸浸泡過程中逐漸發(fā)生溶脹.膠原表觀被明顯破壞。超聲波對(duì)明膠的分子結(jié)構(gòu)起到疏松的效果，雞肺膠原蛋白問原本緊密的交聯(lián)變得松散，有利于后期在酸性條件下進(jìn)行的酶解，使分子間的共價(jià)交聯(lián)和非共價(jià)鍵斷裂，大分子的膠原蛋白絕大多數(shù)被降解為小分子的膠原亞基，可能導(dǎo)致分子間疏水基團(tuán)的暴露，明膠化膠原呈無規(guī)則卷曲狀。超聲輔助酶提明膠具有疏松孔洞的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在糖果工業(yè)中，可作為攪打劑應(yīng)用于軟糖的生產(chǎn)，起吸水、增大體積、維持形態(tài)的作用。

2.8 乳化性

明膠作為一種親水、親油的表面活性劑，肽鏈的疏水基因使其具有一定的乳化性，可以阻止晶體或離子的聚集，穩(wěn)定非均相懸浮液。高速勻漿機(jī)的分散作用使得明膠分子與油滴界面接觸的數(shù)量增多，溶液中的明膠蛋白覆在油滴表面形成水包油的狀態(tài)。制備的兩種明膠的乳化活性無明顯差異，其中超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性((139.92±9.8)min)略低于常規(guī)熱水提取明膠((148.72±11.3)min)，但仍顯著高于鯰魚皮明膠網(wǎng)(＜60min)。乳液中分子間的吸引力與運(yùn)動(dòng)碰撞形成了較大的液滴，其表面的解吸附作用使得液滴變得不穩(wěn)定，均質(zhì)后的明膠會(huì)出現(xiàn)一些較大的乳液液滴。明膠分子與油滴界面問的疏水平衡隨著明膠溶解度的降低而被破壞，超聲輔助酶提明膠的乳化穩(wěn)定性南于乳液粒徑的增大而出現(xiàn)下降，可通過添加表面活性劑或修飾側(cè)鏈基團(tuán)對(duì)酶提明膠進(jìn)行改性。

3 結(jié)語

以雞肺為原料提取明膠，通過分析其結(jié)構(gòu)和乳化性，探究超聲輔助酶法的影響。研究發(fā)現(xiàn)，在超聲波和胃蛋白酶的作用下，雞肺明膠的相對(duì)分子質(zhì)量降低，表面微觀結(jié)構(gòu)疏松破碎，平均粒徑減小13.7％。試驗(yàn)結(jié)果表明，雞肺明膠具有較高的純度，與常規(guī)熱水法相比，超聲輔助酶提明膠的生產(chǎn)周期顯著縮短，得率顯著提高，具有良好的熱穩(wěn)定性與乳化穩(wěn)定性，二級(jí)結(jié)構(gòu)更為有序，可作為魚源明膠的替代品。

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