2.2 大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析

將0TU序列在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，采用MEGA5.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從圖2和圖3結(jié)果可以看出：山西老陳醋大曲中共檢測(cè)到4個(gè)細(xì)菌門，分別是厚壁菌門、變形菌門、放線菌門和擬桿菌門，其中厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，分別占69.67％和29.17％，放線菌門及擬桿菌門僅占0.86％和0.28％。

如圖2所示，厚壁菌門上僅檢測(cè)到桿菌綱，包括的菌屬主要是：乳桿菌屬、芽孢桿菌屬、魏斯氏菌屬、片球菌屬、高溫放線菌屬、明串珠菌屬和科克羅彭斯特菌屬，相對(duì)豐度分別為32.82％.29.45％，2.13％，1.65％，1.01％，0.65％和0.09％。

乳酸菌是大曲和食醋釀造過程中的主要優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，其代謝產(chǎn)生的乳酸等不揮發(fā)性酸可以降低食醋中醋酸的刺激性氣味，改善食醋風(fēng)味，賦予山西老陳醋綿酸醇柔的特點(diǎn)。另外，乳酸菌除產(chǎn)酸外，還可以產(chǎn)生細(xì)菌素等抑菌物質(zhì).在整個(gè)釀造過程中起到抑制雜菌、凈化、保持、改善釀醋微生態(tài)環(huán)境的作用。乳酸菌產(chǎn)生的γ-氨基丁酸(GABA)是近年來揭示的傳統(tǒng)谷物醋中重要功能成分之一。

圖2表明山西老陳醋大曲中的乳酸菌菌群主要是乳桿菌屬。其中，OTU3與瑞士乳桿菌)B1-3相似度達(dá)99％。高亦豹等在江蘇白酒大曲中也檢測(cè)到瑞士乳桿菌。李巖等則從永春老醋發(fā)酵過程樣品中篩選出具有較高耐酸性的瑞士乳桿菌YCL-5，并將其應(yīng)用于葡萄醋的靜置液態(tài)發(fā)酵中，用于改善葡萄醋的發(fā)酵風(fēng)味。OTU33與短乳桿菌SKBl023相似度達(dá)99％。相似地，劉雄等和吳林寰在釀醋大曲和鎮(zhèn)江香醋發(fā)酵過程中也檢測(cè)到短乳桿菌的存在，并推測(cè)短乳桿菌可能是食醋重要功能活性成分—川芎嗪的前體乙偶姻的主要產(chǎn)生菌株。OTUl0與耐酸乳桿菌0JC01相似度為99％，此菌種最初是由Entani等在米醋釀造過程中檢測(cè)到的，該菌能夠以葡萄糖、果糖、甘露糖等多種碳源為底物進(jìn)行發(fā)酵，代謝產(chǎn)物主要為醋酸和乳酸。張榮展等采用PCR-DGGE法也證實(shí)了耐酸乳桿菌在天津獨(dú)流老醋釀造中的存在，由于其具有較強(qiáng)的耐酸性，因此是發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌群。OTUl5與橋乳桿菌HBUAS52247同源性達(dá)99％。橋乳桿菌最初是在開菲爾粒中被發(fā)現(xiàn)，是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株，能發(fā)酵己糖產(chǎn)生乳酸、乙醇和二氧化碳。姚粟等和高亦豹等分別在芝麻香型白酒大曲和江蘇白酒大曲中檢測(cè)到橋乳桿菌。橋乳桿菌也在發(fā)酵酸面團(tuán)和發(fā)酵豆乳清等其它發(fā)酵食品中被檢測(cè)到。

它發(fā)酵食品中被檢測(cè)到。除乳桿菌屬外，魏斯氏菌屬、片球菌屬和明串珠菌屬也是乳酸菌的重要菌屬。0TU53和0TU2分別與綠色魏斯氏菌FB077和融合魏斯氏菌HBUAS54389相似度最高(100％)。魏斯氏菌屬具有很強(qiáng)的產(chǎn)β-葡糖苷酶的能力，能夠參與發(fā)酵底物中纖維素的降解，另外，具有產(chǎn)乳酸、產(chǎn)胞外多糖、產(chǎn)抑菌物質(zhì)等特性，近年來在食品發(fā)酵工業(yè)中開始受到關(guān)注。與本文研究結(jié)果相似，Nie等利用PCR-DGGE技術(shù)在山西老陳醋大曲和酒醪中檢測(cè)到綠色魏斯氏菌和融合魏斯氏菌。孫峰宇則從食醋酒醅中分離純化到1株微小魏斯氏菌，并將其與酵母菌進(jìn)行協(xié)同醋酸發(fā)酵。最終使醋醅中的乳酸含量提高了2.10倍，檸檬酸含量提高了4.5倍，酯類含量提高了10％，有效改善了液態(tài)釀造食醋的風(fēng)味。OTUll與乳酸片球菌C1-36-L4a相似性達(dá)100％。Ln等和葉光斌等在瀘州老窖高溫大曲和武夷紅曲糯米酒發(fā)酵液中也檢測(cè)到了乳酸片球菌。本文還檢測(cè)到假腸膜明串珠菌的存在。明串珠菌屬是典型的異型乳酸發(fā)酵菌株，能發(fā)酵糖類產(chǎn)生多種酸和醇，還能代謝檸檬酸產(chǎn)生風(fēng)味成分雙乙酰圈。具有抗氧化和拮抗致病菌等能力，常用于發(fā)酵乳制品、泡菜和果酒中。劉蕓雅等對(duì)紹興黃酒麥曲的研究發(fā)現(xiàn)，明串珠菌屬在麥曲制備后期逐漸增加。并和乳桿菌屬協(xié)同分泌乳酸，從而為酵母菌的生長(zhǎng)繁殖提供適宜的酸性環(huán)境。焦玉雙等將假腸膜明串珠菌L18強(qiáng)化應(yīng)用在老陳醋發(fā)酵中，最終使新淋醋中不揮發(fā)酸含量得到顯著提高。

圖2結(jié)果顯示，OTU97與0TU4分別與解淀粉芽孢桿菌SXKFl6-5和HYM25相似度達(dá)到99％，0TU7和0TU23則與地衣芽孢桿菌KW55P和SSl的相似度達(dá)99％和100％。研究表明，解淀粉芽孢桿菌為醬香型白酒大曲中的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，在大曲制備過程中人為接種地衣芽孢桿菌后，顯著提升了大曲的淀粉酶活性和醬香型大曲典型風(fēng)味物質(zhì)—己酸乙酯的含量。另外，吳林寰采用宏基因測(cè)序揭示芽孢桿菌能以己糖為碳源生成乙偶姻，乙偶姻累積到一定程度后與重要中間代謝產(chǎn)物異硫氰酸酯(C₅H₉NS)反應(yīng)，環(huán)化、脫羧、脫硫后可生成食醋重要功能活性成分—川芎嗪，故芽孢桿菌是提升食醋營(yíng)養(yǎng)功能價(jià)值的重要菌種。

高溫放線菌具有明顯的嗜高溫特性，常見于自然界的高溫場(chǎng)所，如堆肥、稻草、蔗渣等，具有產(chǎn)細(xì)胞溶解酶、嗜熱淀粉酶和新普魯蘭的功能，是研究嗜熱酶的重要微生物。近年來，一些學(xué)者相繼從多種類型大曲中發(fā)現(xiàn)了高溫放線菌的存在。葉光斌等通過構(gòu)建瀘州老窖高溫大曲細(xì)菌16SrRNA基因克隆文庫，檢測(cè)到普通高溫放線菌及高溫放線菌。相似地，葛媛媛等圈也從芝麻香型白酒大曲中分離到1株普通高溫放線菌，研究證實(shí)其具有嗜高溫、產(chǎn)堿性磷酸鹽酶、酯酶、類酯酶等特性。本文首次在山西老陳醋大曲中檢測(cè)到高溫放線菌，關(guān)于其在食醋大曲和釀造中的作用機(jī)制及開發(fā)利用尚待進(jìn)一步研究。

0TU28與血液克羅彭斯特菌X0394相似性達(dá)100％。姚粟等采用構(gòu)建16SrDNA克隆文庫的方法研究芝麻香型白酒高溫大曲的細(xì)菌群落，發(fā)現(xiàn)克羅彭斯特菌是大曲中的第2優(yōu)勢(shì)菌屬，其發(fā)現(xiàn)的象牙色克羅彭斯特菌屬首次報(bào)道，目前尚未有關(guān)于其功能的研究報(bào)導(dǎo)。劉延波等閉利用高通量測(cè)序技術(shù)在濃香型白酒大曲中也檢測(cè)到克羅彭斯特茵，并證實(shí)此菌種由于不耐高溫，在大曲制備后期豐度顯著下降。

非厚壁菌門細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示，變形菌門的γ-變形菌綱，檢測(cè)到的菌屬包括泛菌屬和不動(dòng)桿菌屬，分別占27.36％和0.80％。

泛菌屬是常見的植物內(nèi)生菌，具有很強(qiáng)的固氮活性和促生作用，能以木質(zhì)素為碳源。代謝生成醇類物質(zhì)，其次級(jí)代謝產(chǎn)物具有廣譜抗菌活性阿。本文檢測(cè)到的泛菌屬的菌種主要是成團(tuán)泛菌、彩花泛菌和布氏泛菌，可能來源于制曲的原料大麥或豌豆中。泛菌屬產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能在長(zhǎng)達(dá)21d的制曲和3～6個(gè)月的大曲成熟和儲(chǔ)存期間起著抑制雜菌的作用。Li等閉研究發(fā)現(xiàn)，泛菌屬具有編碼β-葡萄糖苷酶的基因，除分解底物中的纖維素類物質(zhì)外，還參與形成烯萜類化合物，可賦予食醋果香及酯香等風(fēng)味。另外，成團(tuán)泛菌還能發(fā)酵D-葡萄糖和其它糖類產(chǎn)生有機(jī)酸，提升食醋中不揮發(fā)性酸的含量。
檢測(cè)到的不動(dòng)桿菌主要是約氏不動(dòng)桿菌和不動(dòng)桿菌。王曉丹等研究證實(shí)不動(dòng)桿菌屬是遵義地區(qū)醬香型大曲重要細(xì)菌類群之一，可分泌重要的生物活性物質(zhì)，如抗生素、酶和維生素，還能產(chǎn)生磷脂和葉黃素等功能活性物質(zhì)。

放線菌門上主要檢測(cè)到直桿糖多孢菌和霍爾迪糖多孢菌。相似地Nie等和Li等也曾采用DGGE技術(shù)在山西老陳醋大曲中檢測(cè)到直桿糖多孢菌的存在，并證實(shí)此類菌屬能代謝糖類生成揮發(fā)性脂肪酸。

除食醋生產(chǎn)大曲外，白酒大曲中也有發(fā)現(xiàn)糖多孢菌屬菌群的報(bào)道，研究表明其可產(chǎn)生抗腫瘤抗生素、多種酶類、酶抑制劑等多種生物活性物質(zhì)。

本文首次在食醋大曲中檢測(cè)到北黃黃桿菌的存在。關(guān)于黃桿菌屬，是1923年由Bergey首次從海洋沉積物中分離并命名的，目前已包含60多種模式菌株，關(guān)于其在大曲中存在的作用和意義，今后需進(jìn)一步進(jìn)行研究。

3 結(jié)論

本文主要采用高通量測(cè)序技術(shù)揭示山西老陳醋大曲的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，證明厚壁菌門和變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌門。芽孢菌屬、乳桿菌屬和泛菌屬為主要的優(yōu)勢(shì)菌屬，其中與瑞士乳桿菌、短乳桿菌、耐酸乳桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和成團(tuán)泛菌等具有很高的相似性。菌群結(jié)構(gòu)的揭示，為解析山西老陳醋微生物釀造機(jī)理、強(qiáng)化菌種制曲、大曲制備工藝革新等奠定了基礎(chǔ)，對(duì)傳統(tǒng)山西老陳醋的現(xiàn)代生物技術(shù)創(chuàng)新提升。產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型、升級(jí)具有重要意義。

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