食源性致病菌的污染和增殖是嚴重威脅食品安全和公共健康的因素之一，成為人們關注的熱點問題。根據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，世界上每年有近十分之一的人因食品污染而患病，近42萬人死于食源性疾病。食品添加劑作為延長食品貨架期的一種手段，可以抑制食源性致病菌的生長，然而食品添加劑潛在危害及添加劑量成為消費者擔憂的問題。同時，抗生素作為主要抑制食源性疾病的源頭藥物，其長期濫用導致食源性致病菌的耐藥性問題愈發(fā)嚴重。鑒于此，研究人員不斷尋找天然的防腐劑以及不易產(chǎn)生耐藥性的天然抗菌物質(zhì)作為食品添加劑及抗生素的替代品。

細菌素是細菌核糖體內(nèi)合成的一類具有抑菌活性的多肽或蛋白類物質(zhì)，主要對親緣關系較近的微生物有一定的抑制作用。細菌素具有高效、無毒、穩(wěn)定性強、無殘留以及不易產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點，被普遍認為是抗生素及化學添加劑的替代物之一。目前真正用于商業(yè)化的乳酸菌細菌素僅有乳酸鏈球菌素（nisin）和片球菌素（pediocinPA1）。造成這種現(xiàn)象的原因主要是乳酸菌細菌素的性質(zhì)（如有些乳酸菌細菌素抑菌譜窄、pH敏感性及熱穩(wěn)定性差）和分離純化方法等諸多因素限制了乳酸菌細菌素的獲取及其工業(yè)化生產(chǎn)。篩選具有廣譜抑菌作用，pH耐受范圍廣，熱穩(wěn)定性好的新型細菌素對食品安全具有重要意義。

芽孢桿菌（Bacillussp.）作為動植物和微生態(tài)的優(yōu)勢菌，不僅種類繁多、穩(wěn)定性強，而且廣泛存在于自然界中。由芽孢桿菌中地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）、枯草芽孢桿菌（B.subtilis）、凝結(jié)芽孢桿菌（B.coagulans）等產(chǎn)生的細菌素也逐步被關注和發(fā)現(xiàn)。本研究從福建霞浦海域的牡蠣中分離出不同的細菌，并以常見的食源性致病菌：金黃色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、蠟樣芽孢桿菌（B.cereus）、副溶血性弧菌（Vibrioparahemolyticus）等為指示菌，系統(tǒng)篩選具有廣譜抑菌作用的產(chǎn)細菌素的細菌。其中分離出具有廣譜抑菌活性的14株細菌經(jīng)16srDNA基因鑒定為芽孢桿菌。這些芽孢桿菌所產(chǎn)的細菌素主要是由核糖體合成，并具有熱穩(wěn)定性和酶敏感性等特點。結(jié)合Ｔricine-SDS-PAGE電泳試驗結(jié)果及LC-MS/MS鑒定，潛在細菌素的分子質(zhì)量范圍及對應的氨基酸序列均顯示上述廣譜細菌素可能未被發(fā)現(xiàn)。本研究發(fā)現(xiàn)的新型廣譜細菌素期望為細菌素的開發(fā)利用及其在食品安全領域的應用提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品

牡蠣產(chǎn)自福建霞浦海域，樣品放置于-18℃運至實驗室備用。

1.2.1 試驗設備

低溫恒溫培養(yǎng)箱（MIR-153），日本三洋（SANYO）電機公司；立式壓力蒸汽滅菌器（YXQ-LS-50SII），上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；水平電泳槽及成像系統(tǒng)，美國Bio-rad公司；超凈工作臺（SEX-ＴＪ），上海整新電子設備；天平Y(jié)P200N，上海菁海儀器有限公司；PCR儀（2720ＴhermalCycler），美國Ｔhermo公司；樣品處理儀（MPFastprep-24），美國MP公司。

1.2.2 主要試劑

瓊脂粉，上海藍季生物科技有限公司；甘油、瓊脂糖，均購于國藥；基因組DNA提取試劑盒、DNAMaker、4sGreen無毒核酸染料、PCR引物，上海生工生物技術(shù)有限公司；Ｔaq酶、ddH2O，上海拜力生物科技有限公司；腦心浸出液（BrainHeartInfusion，BHI）培養(yǎng)基、乳酸菌培養(yǎng)基（MRS），英國OXIOD公司。

1.2.3 指示菌株

本次試驗的指示菌株均由中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所保存，所需的指示菌及培養(yǎng)條件等見表1。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

無菌條件下，稱取10g牡蠣肉剪碎研磨，添加到裝有90mL生理鹽水的樣品處理袋中，將樣品在處理器中均質(zhì)混勻2min，用生理鹽水梯度稀釋至10^-4備用。

1.3.2 菌株分離與培養(yǎng)

采用稀釋涂布平板法對細菌進行單菌落分離。分別從10^-3、10^-4兩個稀釋度的稀釋液中吸取100μL樣品液于BHI培養(yǎng)基上，均勻涂布后置于30℃條件下過夜培養(yǎng)。長出菌落后，無菌條件下挑選單菌落，接種于5mLBHI液體培養(yǎng)基中，置于30℃條件下過夜培養(yǎng)。

1.3.3 產(chǎn)細菌素菌株的篩選

1.3.3.1 初篩

采用瓊脂點種法進行細菌素初篩試驗。將100μL過夜培養(yǎng)的指示菌添加到5mLBHI培養(yǎng)基（含0.8%的瓊脂粉）中，倒入BHI培養(yǎng)基（含2.5%的瓊脂粉）上，均勻平鋪。待其冷卻凝固并且干燥后，吸取2μL指標菌進行點樣，置于30℃條件下過夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，在培養(yǎng)基上出現(xiàn)明亮抑菌圈的則認為有抑菌活性，能抑制相應的指示菌。對有抑菌活性的菌株在體積分數(shù)13%的甘油中保存，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3.2 細菌素對熱和酶的穩(wěn)定性測試

1）細菌素的熱穩(wěn)定性試驗：將過夜培養(yǎng)的指標菌液在10000r/min條件下離心5min。將上清液在沸水中放置15min，然后冰上冷卻5min。吸取3μL加熱后的上清液，進行瓊脂點種法進行抑菌，未經(jīng)熱處理的上清液作為對照。

2）細菌素對酶的穩(wěn)定性測試：將指標菌過夜培養(yǎng)，吸取2μL菌液，采用瓊脂點種法進行抑菌試驗；在點過指標菌位置的邊緣，點上1μL質(zhì)量濃度為20μg/mL的蛋白酶K，30℃條件下過夜培養(yǎng)。未經(jīng)蛋白酶K處理的菌液作為對照。

1.3.4 產(chǎn)細菌素菌株的分類鑒定

1.3.4.1 形態(tài)特征

參照文獻進行菌株形態(tài)特征鑒定。將菌株接種于BHI平板，37℃過夜培養(yǎng)，觀察各個平板菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色法觀察細菌形態(tài)。

1.3.4.2 菌株基因組DNA提取，PCR擴增和菌株鑒定

對具有抑菌效果的指標菌，按生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）提供的使用方法提取其DNA。以指示菌基因組DNA作為PCR擴增的模板，采用通用引物15F和12R（表2）進行PCR擴增。PCR反應體系（50μL）：ＴaqPCRMasterMix（2x，bluedye）（上海生工）25μL，上游引物（10μmol/L）2μL，下游引物（10μmol/L）2μL，基因組DNA模板2μL，雙蒸水19μL。擴增反應條件為：94℃預變性4min；進入PCR循環(huán)階段后，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，共30個循環(huán)；72℃延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳后在UＶ燈下觀察到擴增條帶后將未純化的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行菌種鑒定。測序結(jié)果所得的基因序列通過在NCBI的Blast檢索系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫中進行BLASＴ序列比對。

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