芽孢是細(xì)菌在環(huán)境脅迫（如低溫、干旱和營養(yǎng)缺乏等）下形成的休眠體。因其獨特的結(jié)構(gòu)特性而對高溫、高壓、干燥、輻射、低溫、腐蝕性物質(zhì)等具有極強(qiáng)的抗性。如何將芽孢殺滅一直是食品殺菌領(lǐng)域亟待突破的關(guān)鍵問題?，F(xiàn)階段殺滅芽孢主要是靠傳統(tǒng)的高溫、高壓的方法，然而高溫、高壓在殺滅芽孢的同時，也會引起食品營養(yǎng)流失，口感、風(fēng)味等品質(zhì)的嚴(yán)重下降。如何在常溫下殺滅芽孢一直是食品領(lǐng)域研究人員的一大挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)芽孢萌發(fā)后，其抗性消失，這也為殺滅芽孢提供了一個有效策略。如今，先萌發(fā)后殺滅是殺滅芽孢的一個最有效途徑。

肽聚糖是細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，由N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）和N-乙酰胞壁酸（MurNac）通過β-1，4糖苷鍵連接聚合而成。與MurNac相連的依次是L-Ala，γ-Glu，m-Dpm和D-Ala。革蘭氏陰性菌和陽性菌的主要區(qū)別在第3個氨基酸，大多數(shù)陽性菌的第3個氨基酸是L-Lys。胞壁肽是肽聚糖酶解后產(chǎn)物。研究表明，含有Dpm的胞壁肽是一種有效的萌發(fā)劑，能促進(jìn)芽孢萌發(fā)。最小的有效結(jié)構(gòu)單元的胞壁肽為二糖三肽，其二聚體或三聚體依然能誘導(dǎo)芽孢萌發(fā)?，F(xiàn)如今，國內(nèi)還沒有關(guān)于胞壁肽分離純化的報道，也沒有關(guān)于胞壁肽對芽孢萌發(fā)的影響研究。本文通過酶解等方法成功分離純化了胞壁肽，研究胞壁肽對于芽孢萌發(fā)的影響，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

枯草芽孢桿菌（Bacillus.subtilis168），購自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.2試驗試劑

LB液體培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；BacterialAgar（BD）；α-淀粉酶、胰蛋白酶、變?nèi)芫兀徺I自美國Sigma公司；其它試劑均為分析純。

1.3儀器及設(shè)備

倒置熒光顯微鏡，德國蔡司公司；高效液相色譜，日本島津公司；超高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國沃特世公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；傅里葉變換紅外光譜掃描儀，美國鉑金埃爾默公司；500兆核磁共振譜儀，瑞士布魯克公司；壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；均質(zhì)破碎儀，美國Fastprep24；冷凍離心機(jī)，日本日立公司。

1.4試驗方法

1.4.1枯草芽孢桿菌芽孢的制備

菌種先用LB瓊脂培養(yǎng)基活化3代以上，接入2×SG培養(yǎng)基中涂板培養(yǎng)。在37℃培養(yǎng)2d后，用相差顯微鏡鏡檢芽孢，當(dāng)視野中大部分芽孢從母細(xì)胞中脫落后，用冷的無菌去離子水將培養(yǎng)基上的芽孢清洗收集到離心管中，離心條件為8000g、4℃、10min，離心數(shù)次。離心過程中保證全程在低溫條件中進(jìn)行。離心后除去上清液，獲得的芽孢沉淀重懸于ACES緩沖液（0.05mol/L，pH7.0）中，最后用相差顯微鏡鏡檢，視野中≥95%的芽孢呈現(xiàn)明亮狀方可使用。芽孢濃度約為1.0×10⁸CFU/mL，存放于4℃冰箱，1個月內(nèi)使用。

1.4.2芽孢平板計數(shù)

將芽孢懸浮液進(jìn)行梯度稀釋，枯草芽孢桿菌芽孢采用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行傾注平板計數(shù)，每個平板中加入1mL稀釋菌液?？莶菅挎邨U菌芽孢在37℃條件下進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)24h。殺菌效果用芽孢減少的對數(shù)表示：lg（Nt/N0），其中，Nt為處理后存活的菌落數(shù)，N0為處理前菌落總數(shù)。

1.4.3芽孢萌發(fā)試驗

吸取適量芽孢液于離心管中，加入適量萌發(fā)劑。放置在搖床中培養(yǎng)1h（37℃，200r/min）。之后將芽孢液放入80℃水浴中加熱20min。平板計數(shù)計算芽孢萌發(fā)率。

1.4.4肽聚糖的提取

采用枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis168）的細(xì)胞壁提取肽聚糖。購買的菌種在液體培養(yǎng)基中活化3代后使用。將枯草芽孢桿菌接種到LB瓊脂培養(yǎng)基上，于37℃培養(yǎng)24h。取新鮮單菌落接種到適量的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600約1.0，離心收集菌體（8000×g、4℃、10min），用冷的無菌去離子水清洗2次。將沉淀重新懸浮于8%SDS溶液中，煮沸30min，離心（13000×g，15min，25℃）收集沉淀，清洗數(shù)次直至除去殘留的SDS。SDS處理除去了菌體的其它蛋白質(zhì)，非共價結(jié)合的脂蛋白和脂多糖。將沉淀溶于無菌去離子水中均質(zhì)破碎儀破碎細(xì)菌，不溶性細(xì)胞壁組分再通過離心收集（40000×g，30min，25℃）。收集的不溶性細(xì)胞壁進(jìn)一步用α-淀粉酶、胰蛋白酶進(jìn)行酶解，以除去細(xì)胞壁上的糖原、共價結(jié)合的蛋白質(zhì)。以上兩步酶解均在緩沖液中進(jìn)行（10mmol/LＴris-HCl，pH8.0），在胰蛋白酶中需要加入10mmol/LCaCl2。將酶解液加入SDS（終質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%）煮沸鈍化胰蛋白酶，并清洗除去SDS。將細(xì)胞壁重新懸浮于氫氟酸（5mg細(xì)胞壁懸浮于2mL48%HF）中，4℃處理48h。HF可以除去肽聚糖上磷酸二酯鍵共價連接的次生細(xì)胞壁多糖，包括磷壁酸、poly-（β，1-6GlcNAc）等。細(xì)胞壁組分再分別采用8mol/LLiCl和0.1mol/LEDＴA清洗，無菌水清洗2次，最后采用丙酮除去脂磷壁酸和脂多糖。將樣品凍干，得到肽聚糖。

1.4.5胞壁肽分離純化

將提取的肽聚糖懸浮于12.5mmol/L磷酸鹽緩沖液（1mmol/LMgCl2，pH6.0，0.02%疊氮化鈉）中，加入5μg/mL變?nèi)芫?，?7℃酶解24h。酶解的胞壁肽需要采用硼氫化鈉還原，防止Cl的異構(gòu)化。將胞壁肽懸浮于100mL0.5mol/L的硼酸鹽緩沖液（pH9.0）中。胞壁肽還原采用新鮮配制的25mL，25mg/mLNaBH4，在加入過程中使pH保持在9.0。還原反應(yīng)在室溫中保持15min并不停地振蕩，加入H3PO4使反應(yīng)終止，將pH調(diào)至4。所得樣品保存在-20℃。還原的胞壁肽采用HPLC（Shimadzu）分離，ODS色譜柱（Hypersiloctadecylsilanecolumn，250mm×4.6mm，顆粒：5μm，30105-254630，ＴhermoFisherScientific）。洗脫液分別是：A，40mmol/L磷酸鈉（pH4.5）；B，40mmol/L磷酸鈉（pH4.0）并加入20%（體積分?jǐn)?shù)）甲醇。A、B流動相中加入0.00025%的疊氮化鈉。色譜柱平衡柱子采用流動相A，柱溫52℃，流速0.5mL/min，平衡1h?？扇苄园陔倪M(jìn)樣100μL，進(jìn)樣5min后，洗脫程序為B流動相以線性梯度從0到100%，時間為5min到270min，流動相流速保持在0.5mL/min。胞壁肽組分檢測采用紫外檢測器，波長為206nm

1.4.6胞壁肽組分脫鹽

胞壁肽組分凍干后重新懸浮于無菌超純水中，采用HPLC法進(jìn)行脫鹽，色譜柱為前述分離柱。柱子采用0.007%（體積分?jǐn)?shù)）三氟乙酸平衡，柱溫35℃，流速1mL/min，胞壁肽采用50%甲醇（0.0025%三氟乙酸）線性梯度（0～100%）洗脫，洗脫時間在30～50min之間，胞壁肽組分檢測采用紫外檢測器，波長為206nm。

1.4.7三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜鑒定

脫鹽的胞壁肽組分采用三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（QuattroMicro，Micromass）進(jìn)行鑒定。全掃描模式（MSScan）質(zhì)譜條件：正離子（ESI⁺）數(shù)據(jù)采集模式產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰[M+H]⁺；m/z掃描范圍100～2000u；毛細(xì)管電壓3.5kＶ；錐孔電壓40Ｖ；萃取電壓5.0Ｖ；離子源溫度110℃；脫溶劑溫度450℃；脫溶劑氣650L/h；錐孔反吹氣50L/h；RF透鏡電壓0.5Ｖ。

1.4.8紅外掃描光譜

采用壓片法將1.5mg凍干的GM-ＴriDAP與200mg干燥的KBr在瑪瑙研缽中混合研磨均勻，置于磨具中，用壓片機(jī)進(jìn)行壓片（壓力為20～30MPa）1min，取下后得到透明的樣品薄片，用傅里葉變換紅外譜儀進(jìn)行紅外光譜的掃描，掃描范圍4000～500cm^-1。

1.4.91HNMR

將2mg凍干的GM-ＴriDAP樣品溶于1mLD2O中，冷凍干燥并重復(fù)3次將糖肽中的活潑H置換，溶于0.5mLD2O中后置于核磁管中，核磁共振分析采用500兆核磁共振譜儀，室溫20℃，500MHz作氫譜。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

所有試驗均重復(fù)3次。繪圖使用Origin8.5軟件。

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