水產(chǎn)品口感鮮美、營養(yǎng)豐富，深受消費(fèi)者的喜愛，然而，水產(chǎn)品極易腐敗變質(zhì)，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于微生物的生長和入侵是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗的主要因素，因此水產(chǎn)品的保鮮過程中對微生物的抑制十分重要。低溫保鮮技術(shù)是使用最早，也是應(yīng)用最廣的水產(chǎn)品保鮮技術(shù)。低溫會使微生物的生理機(jī)能發(fā)生重要的變化，比如膜流動性降低，核酸二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性增強(qiáng)，轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白折疊的效率降低等。在低溫下有些微生物仍能以一定的生長速率生長，即使生長較慢。腐敗希瓦氏菌是一種耐冷菌，在0℃下也能生長、繁殖，其在有氧冷凍或冷藏狀態(tài)下是多種水產(chǎn)品的特定腐敗菌，引起冷藏水產(chǎn)品的腐敗變質(zhì)，這嚴(yán)重降低了水產(chǎn)品的品質(zhì)，極有可能導(dǎo)致食品安全問題。鑒于水產(chǎn)品保鮮的重要經(jīng)濟(jì)價值，深入了解腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)的分子機(jī)制，可以輔助預(yù)測腐敗菌在冷藏食品中的行為，便于進(jìn)行更準(zhǔn)確的風(fēng)險預(yù)測和防范。

研究發(fā)現(xiàn)，微生物在低溫作用下會產(chǎn)生冷應(yīng)激反應(yīng)，生成一系列的抗低溫蛋白，稱為冷激蛋白。細(xì)菌冷激蛋白是一類包含核酸結(jié)合冷休克結(jié)構(gòu)域的高度保守的小分子蛋白（～7.4ku），可以作為分子伴侶與單鏈DNA或單鏈RNA結(jié)合，阻止DNA或RNA在低溫下形成二級結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)轉(zhuǎn)錄和翻譯。此外，冷激蛋白還參與細(xì)菌的多個生理生化過程，如：細(xì)胞膜的流動性，細(xì)菌正常生長與分化，營養(yǎng)脅迫，細(xì)菌的毒力等。冷激蛋白對細(xì)菌在低溫時恢復(fù)生長和發(fā)揮細(xì)胞各種功能是非常重要的，是解析微生物低溫適應(yīng)機(jī)制的關(guān)鍵蛋白。然而，目前關(guān)于腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的研究鮮有報道。

細(xì)菌通常具有多個冷激蛋白，且冷激蛋白的作用規(guī)律十分復(fù)雜，并非所有冷激蛋白都受低溫誘導(dǎo)表達(dá)。通過對NCBＩ數(shù)據(jù)庫中腐敗希瓦氏菌模式菌株的全基因組序列檢索，發(fā)現(xiàn)腐敗希瓦氏菌中存在3個典型冷激蛋白，目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)其主要冷激蛋白及相關(guān)功能的研究。本文以水產(chǎn)品的腐敗希瓦氏菌為研究對象，通過PCR擴(kuò)增獲得水產(chǎn)品腐敗希瓦氏菌的3個冷激蛋白基因序列，在此基礎(chǔ)上通過生物信息學(xué)分析腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)和功能特性等，旨在為冷激蛋白在腐敗希瓦氏菌低溫適應(yīng)過程中的功能研究，以及對水產(chǎn)品中腐敗希瓦氏菌的抑制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腐敗希瓦氏菌為本實(shí)驗(yàn)室自腐敗的冷藏大菱鲆中分離所得，于-80℃保藏。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polemerasechainreaction，PCR）引物委托生工生物工程（上海）技術(shù)服務(wù)有限公司合成

EasyTaqRDNAPolymerase，北京全是金生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、GeneRed核酸染料，天根生化科技（北京）有限公司；Biowest瓊脂糖、LB營養(yǎng)瓊脂、LB營養(yǎng)肉湯，青島高科園海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

防蒸發(fā)梯度PCR，美國Eppendrof公司；凝膠電泳及配套設(shè)備，美國Bio-Bad公司；微量冷凍離心機(jī)，美國Thermo公司。

1.3 菌種鑒定及冷激蛋白基因的克隆與測序

活化本實(shí)驗(yàn)室保藏的腐敗希瓦氏菌，按照基因組DNA提取試劑盒的操作步驟提取基因組DNA，利用細(xì)菌16SrRNA基因通用引物27F和1492R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得腐敗希瓦氏菌的16SrRNA基因（表1）。采用NCBＩ檢索近緣腐敗希瓦氏菌菌株基因組信息（GenBank：CP002457.1），依據(jù)注釋冷激蛋白基因及其上、下游序列，設(shè)計引物（表1），進(jìn)行冷激蛋白的Csp1589，Csp1376和Csp2252基因的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件為94℃5min；94℃30s，Tm℃30s（詳見表1），72℃45s，循環(huán)30次。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工測序。

1.4 系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

自NCBＩ數(shù)據(jù)庫獲得大腸桿菌（NC_000913.3）的9個冷激蛋白（CspA～Ｉ），以FASTAfile形式保存。通過軟件ClustalX對測序所得腐敗希瓦氏菌冷激蛋白和大腸桿菌的冷激蛋白進(jìn)行序列比對，并用Mega7.0中的鄰接法（Neighbor-jioningmethod，NＪ）為其構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹，步長值（Bootstrapvalues）為1000。

1.5 冷激蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)域的預(yù)測

ExPASy網(wǎng)站中的一個工具ProtParam來預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的基本生理、生化特征，用PSORTwwwServer中的PSORTPrediction工具預(yù)測冷激蛋白細(xì)胞定位，用TMHMMServer2.0預(yù)測冷激蛋白跨膜區(qū)域，用SignalＩP5.0在線預(yù)測冷激蛋白信號肽，用SMART預(yù)測冷激蛋白結(jié)構(gòu)域的構(gòu)成及其功能，用在線軟件NCBＩConservedDomainSearch進(jìn)行其氨基酸保守序列分析。

1.6 結(jié)構(gòu)預(yù)測與模型質(zhì)量評估

使用PSＩPRED預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的二級結(jié)構(gòu)。將腐敗希瓦氏菌冷激蛋白的氨基酸序列提交到SWＩSS-MODEL網(wǎng)站進(jìn)行三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測。將構(gòu)建的蛋白三級模型用PROCHECK和Ｖerify3D進(jìn)行質(zhì)量評估。PROCHECK和Ｖerify3D是SAＶESv5.0中的結(jié)構(gòu)評估服務(wù)。

1.7 互作蛋白及配體結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測

用STRＩNG工具確定在活體內(nèi)與腐敗希瓦氏菌冷激蛋白存在相互作用的蛋白。這種相互作用既包括蛋白質(zhì)之間直接的物理相互作用，也包括蛋白質(zhì)之間間接的功能相關(guān)性。將從SWＩSS-MODEL得到的模型文件輸入COACH，以預(yù)測腐敗希瓦氏菌冷激蛋白潛在的配體結(jié)合位點(diǎn)。

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