太子參為石竹科植物孩兒參的塊根，全國各地均有種植，主要產(chǎn)自于福建、江蘇、貴州等地，具有益氣健脾，生津潤肺之功效，已被衛(wèi)計委確定列入“可用于保健食品的中藥材名單”，以飲食養(yǎng)生為主的藥膳食用習(xí)慣更為普遍，具有良好的藥用價值和保健作用。已研發(fā)生產(chǎn)典型的藥品、功能與保健食品有太子參復(fù)方顆粒、口服液、養(yǎng)生酒等。隨著太子參生物活性研究的不斷深入，其在藥品和功能食品方面的研究與應(yīng)用前景廣闊。已報道具有環(huán)肽、多糖、皂苷、氨基酸等多種活性成分，而關(guān)于太子參的功能研究則主要集中在太子參粗提物的心臟保護作用、降血糖、免疫調(diào)節(jié)和抗疲勞作用，但對腸道功能特性的研究較少有報道。

當(dāng)機體細(xì)胞內(nèi)的自由基累積到一定程度會破壞機體氧化/抗氧化的平衡，產(chǎn)生氧化應(yīng)激，生物細(xì)胞內(nèi)DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等生物分子就會發(fā)生改變甚至被破壞，如DNA修復(fù)機制受到破壞從而增強DNA突變的產(chǎn)生，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生改變從而喪失蛋白質(zhì)功能等，因此氧化應(yīng)激與人類系統(tǒng)疾病的發(fā)生有著密切聯(lián)系，而腸道作為物質(zhì)吸收和能量代謝的主要器官，極易受到自由基攻擊造成功能異常，影響機體代謝從而引發(fā)多種慢性疾病。許多研究已經(jīng)證明腸道菌群能影響宿主的氧化/抗氧化水平，益生菌產(chǎn)生的超氧化物、過氧化氫酶及抗氧化代謝物，刺激宿主的抗氧化系統(tǒng)，可保護宿主細(xì)胞免受氧化應(yīng)激等多種因素的影響，激活抗氧化信號通路。

本研究以太子參為原材料，通過實驗室提取與初步純化得到太子參醇提物，利用D-半乳糖致?lián)p動物模型初步研究太子參醇提物提高臟器抗氧化酶活的同時明確其對抗氧化相關(guān)腸道菌群具有積極作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太子參購自福建咸康藥業(yè)有限公司，粉碎過40目備用。清潔級ICR小鼠購自福建醫(yī)科大學(xué)試驗動物中心，許可證號為SCXK（閩）2016-0002。香草醛，α-萘酚阿拉丁試劑（上海）有限公司；冰醋酸，亞硝酸鈉，苯酚，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯化鋁，上海泰坦科技股份有限公司；Rb1標(biāo)準(zhǔn)品，安徽西青果生物科技有限公司；蘆丁，北京索萊寶科技有限公司；D101大孔樹脂，艾美科?。ㄖ袊┥镝t(yī)藥有限公司。D-半乳糖，Sigma公司；注射用生理鹽水，福州海王福藥制藥有限公司；蛋白定量測定試劑盒，總超氧化物歧化酶（T-AOC），谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX），總抗氧化能力（T-AOC）測定試劑盒，南京建成科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1780紫外分光光度計，日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國華電器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，F(xiàn)DU-1200冷凍干燥機，上海愛朗儀器有限公司；HL-2S恒流泵，上海瀘西分析儀器廠有限公司；SpectraMaxPLUS酶標(biāo)儀，美國MolecularDevices公司；MS3渦旋震蕩，德國IKA公司；HeraeusFresco17離心機，ThermoFisherScientific公司；M199型切片刀，德國萊卡儀器（中國）有限公司；BMJ-A包埋機，常州中威電子儀器有限公司；BA210T型顯微鏡，Motic公司。

1.3 方法

1.3.1 太子參醇提物的制備

粉碎過40目篩的太子參按料液比1:8加入70%乙醇，60℃水浴鍋中回流提取兩次，每次1h，兩次濾液合并于50℃旋蒸濃縮至1/4。太子參濃縮液用石油醚萃取后旋蒸去除石油醚，用水補足體積，稀釋8倍后上大孔樹脂D101，水洗至Molish反應(yīng)至陰性，30%乙醇洗脫，收集洗脫液減壓濃縮，冷凍干燥得粉末。

1.3.2 總糖、黃酮和皂苷含量的測定

1.3.2.1 總糖的測定

采用苯酚-濃硫酸法。取1mL樣品溶液，加5%苯酚1mL，混勻后加5mL濃硫酸，混勻，室溫避光反應(yīng)30min后于490nm處測定吸光度。以葡萄糖為標(biāo)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.2 黃酮的測定

參考KarenPitura等的方法測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2.3 皂苷的測定

取適量樣品溶液于10mL具塞試管中，60℃水浴揮干溶劑，加入0.2mL5%香草醛-冰醋酸溶液，0.8mL高氯酸，混勻，密塞水浴加熱15min后冰水浴冷卻，加入5mL冰醋酸，搖勻，于560nm波長處測定吸光度。以人參皂苷Rb1為標(biāo)準(zhǔn)品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 體內(nèi)抗氧化能力的測定

1.3.3.1 試驗動物的分組與試驗方法

72只雄性ICR小鼠（20±2g）適應(yīng)性喂養(yǎng)3d后隨機分為6組，分別為正常組（NC）、模型組（DG）、陽性對照組（PC）、低劑量組（LPEs）、中劑量組（MPEs）和高劑量組（HPEs），每組12只。除NC組外，其余各組每天頸后背皮下注射1000mg/kgD-半乳糖致氧化損傷，NC組注射生理鹽水。LPEs組、MPEs組和HPEs組小鼠每天50、100、300mg太子參醇提物灌胃，PC組小鼠每日灌服50mg/kgVc，DG組和NC組每日灌胃等體積生理鹽水，試驗周期為5周。試驗期間每天早上8:40～9:40稱量體重，觀察小鼠的一般體征。所有動物試驗均遵照“試驗動物護理和使用指南”進行，并得到福建省醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會的審查和批準(zhǔn)（編號：FJMUIACUC2019-0075）。

1.3.3.2 臟器指數(shù)的測定

試驗周期結(jié)束后，小鼠禁食不禁水12～14h，摘眼球采血后頸部脫臼處死小鼠，迅速取出肝臟、腎臟、腦、脾臟，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈后用濾紙吸干，稱重。計算公式為：

1.3.3.3 臟器抗氧化酶活性測定

CAT、SOD、GXH-PX和MDA的檢測根據(jù)南京建成試劑盒說明書的要求進行，對小鼠肝臟、腎臟、腦部勻漿與血清抗氧化酶活性和MDA含量的檢測。

1.3.3.4 肝臟切片

將小鼠肝組織用10%中性福爾馬林固定然后用乙醇梯度脫水。二甲苯洗脫，然后依次在100%、95%、85%和75%乙醇，依次放置5min；再用蒸餾水浸洗5min，石蠟包埋，切片（5μm）。蘇木素對肝組織進行染色5～10min，蒸餾水沖洗，伊紅染3～5min，蒸餾水沖洗；梯度酒精（95%～100%）脫水，取出后置于二甲苯10min，重復(fù)操作2次，中性樹膠封片，顯微鏡下放大100倍觀察。

1.3.3.5 小鼠盲腸內(nèi)容物的微生物分析

試驗周期結(jié)束后，無菌環(huán)境取出小鼠盲腸內(nèi)容物裝入無菌凍存管，液氮速凍后置-80℃保存。使用TIANampStoolDNAkit試劑盒從小鼠盲腸內(nèi)容物中提取微生物總DNA，對16SrDNA基因V3V4區(qū)進行擴增。擴增體系：5×reactionbuffer5μL，5×GCbuffer5μL，Dntp2μL，正向引物1μL，反向引物1μL，DNA模板2μL，ddH2O8.75μL，Q5DNAPolymerase0.25μL。PCR擴增參數(shù)：初始變性982min℃，變性9815s℃，退火55℃30s，引物延伸7230s℃，延伸725min℃，10Hold℃，25～30個循環(huán)，利用IlluminaMiSeq平臺對群落DNA片段進行雙端測序。

1.3.3.6 小鼠小腸組織形態(tài)

小心取出小腸，用預(yù)冷的生理鹽水將內(nèi)容物沖洗出來后放入中性福爾馬林，用于病理切片分析。

1.2.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

利用DPS7.5軟件進行統(tǒng)計分析，測定結(jié)果以x±s（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示。采用單因素方差分析并用LSD法進行多重比較。

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