1 引言

氯霉素是第一個人工合成的廣譜抗生素，因其效高價廉，在中國畜牧業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，對畜禽疾病的控制和治療起到了重要的作用。隨著氯霉素的廣泛應(yīng)用及研究的深入，發(fā)現(xiàn)其有許多毒、副作用，因此，必須控制氯霉素在動物性食品中的殘留，保障消費者健康與安全。試驗結(jié)果表明，蛋雞多劑量內(nèi)服氯霉素后，氯霉素在雞蛋中的藥動學(xué)特征是：易于吸收，多分布于蛋黃；氯霉素在蛋黃中的殘留水平高，且在蛋黃中的消除較蛋白緩慢。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部第235號公告《動物性食品中獸藥最高殘留限量》規(guī)定氯霉素禁止用于所有食品動物。氟苯尼考是一種農(nóng)業(yè)部批準使用的動物專用抗菌藥，主要用于敏感細菌所致的豬、雞、魚的細菌性疾病，尤其對呼吸系統(tǒng)感染和腸道感染療效明顯，GB31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定家禽產(chǎn)蛋期禁止使用氟苯尼考。目前檢測雞蛋中氯霉素類藥物殘留量主要采用國家標準GB/T22338—2008《動物源性食品中氯霉素類藥物殘留量測定》，在檢測雞蛋過程中發(fā)現(xiàn)一些可以優(yōu)化和改進的步驟。本方法是采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對雞蛋中的氯霉素和氟苯尼考殘留量的檢測方法的研究，雞蛋中的氯霉素、氟苯尼考殘留物通過制備、提取、凈化、氮吹、復(fù)溶，過濾后進液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀進行分析測定。通過改進和優(yōu)化，本方法更加簡便、快捷、準確的測定雞蛋中的氯霉素、氟苯尼考。

2 材料和方法

2.1 試劑與材料

ABSCIEXAPI4000+UPLC/MS/MS質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國ABSciex公司，配有Turbo-V離子源、蠕動泵和Analyst1.5.2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；WatersAcquityUPLC超高效液相色譜儀；WatersACQUITYUPLC BEH1.7μmC18（2.1×100mm），KQ-250DV超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Millipore超純水機（美國Milipore公司）；LC-Si硅膠小柱（3mL，200mg，美國WATERS公司）；0.22μm有機系針筒式微孔濾膜（上海安譜公司）；色譜純乙腈（德國，默克公司）；色譜純甲醇（德國，默克公司）；色譜純正丙醇（德國，默克公司）；色譜純丙酮（賽默飛世爾科技（中國））；色譜純正己烷（羅恩試劑）；XS205DU電子天平（梅特勒）；氯霉素、氯霉素D5和氟苯尼考標準品均購于壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司。

2.2 樣品前處理

雞蛋經(jīng)攪拌混勻，取5g置于50mL離心管中，加入內(nèi)標工作溶液100μL和30mL5%甲酸乙腈溶液，均漿，10000r/min離心5min，取上清液轉(zhuǎn)入250mL分液漏斗中，加入15mL乙腈飽和的正己烷，振蕩5min，靜置分層，乙腈層轉(zhuǎn)移至100mL棕色雞心瓶中，殘渣用30mL乙腈重復(fù)提取一次。混合乙腈層，向雞心形瓶加入5mL正丙醇，40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮至近干。殘渣以5mL丙酮+正己烷（1+9）溶解。殘渣溶解液全部過LC-Si硅膠小柱（預(yù)先以5mL丙酮+正己烷（1+9）活化），再用5mL丙酮+正己烷（6+4）洗脫，收集洗脫液于15mL離心管中，40℃水浴中氮氣吹干，以1mL（v）5%甲酸乙腈復(fù)容，過0.22μm濾膜，待測?？瞻自囼灒撼环Q取樣品，其余操作同上提取凈化步驟。

2.3 儀器條件

液相分離條件：色譜柱：C18色譜柱（2.1mm×100mm，1.7μm）。流動相：A相水；B乙腈。流速：0.3mL/min；柱溫：35℃，進樣體積2μL。梯度洗脫程序見表1。

質(zhì)譜檢測條件：離子源：電噴霧電離源（ESI-）；檢測方式：多選擇反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；噴撞氣CAD：中速；氣簾氣CUR：35psi；噴霧氣GS₁：50psi；輔助加熱氣GS₂：50psi；霧化電壓：-4500V；離子傳輸溫度：550℃。

2.4 標準溶液配制

分別取氯霉素、氟苯尼考標準溶液（1000μg/mL）0.1mL、氯霉素D5內(nèi)標溶液（100μg/mL）0.1mL至100mL容量瓶，用乙腈定容，配制成1μg/mL的標準中間液和100ng/mL氯霉素D5內(nèi)標工作溶液。取1mL標準中間液至10mL容量瓶中，以乙腈稀釋并定容成濃度為100ng/mL的標準工作溶液，分別移取標準工作溶液0.05、0.1、0.5、2.0、5.0mL及氯霉素D5內(nèi)標工作溶液1mL于10mL容量瓶中，用流動相稀釋制成濃度為：0.5、1.0、5.0、20.0、50.0ng/mL的標準工作溶液，吸取0.25mL氯霉素、氟苯尼考標準溶液（1000μg/mL）定容到1mL，得250.0ng/mL標準溶液，氯霉素、氟苯尼考標準曲線范圍0.5、1.0、5.0、20.0、50.0、100.0、250.0ng/mL。氯霉素內(nèi)標濃度為10ng/mL。

3 結(jié)果與分析

3.1 質(zhì)譜條件的確定

氟苯尼考含有酰胺基團，在負離子模式下易形成［M+H］⁺準分子離子，目前研究檢測氟苯尼考（LC-MS/MS）方法均采用負離子模式，分別取100ng/mL氯霉素、氟苯尼考標準溶液、氯霉素D₅內(nèi)標溶液進質(zhì)譜，通過全掃描（SCAN）和選擇離子監(jiān)測（SIM）進行條件優(yōu)化，氯霉素等藥物信息及質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化條件見表2。

3.2 液相條件的確定

流動相水相比較了純水、0.1%甲酸水溶液，5mmol乙酸銨溶液，有機相比較了甲醇和乙腈等組合時色譜峰的出峰情況。用純水作為流動相，水相比較0.1%甲酸水溶液、5mmol乙酸銨溶液，基線噪音略大，水相為0.1%甲酸水溶液，氯霉素、氟苯尼考峰形較好，但是氟苯尼考的響應(yīng)值較純水作為流動相下降很多；用5mmol乙酸銨溶液作為水相，氟苯尼考的響應(yīng)值較純水作為流動相也下降近50%；有機相選用甲醇和乙腈時，使用乙腈時氟苯尼考的響應(yīng)更好，而且最終樣品以5%甲酸乙腈溶解，選擇水和乙腈作為流動相。

3.3 前處理條件優(yōu)化

本文比較了乙腈、1%甲酸乙腈，5%甲酸乙腈作為提取溶劑時加標回收率情況，使用5%甲酸乙腈作為提取溶劑，樣品加標回收率更好，故樣品前處理使用5%甲酸乙腈作為處理溶劑。40℃水浴中氮氣吹干后，復(fù)溶試劑的選擇，GB/T22338—2008標準中以1mL水作為溶劑溶解，通過實驗比較表明：水作為復(fù)溶的溶劑做出的回收率較低，特別對于氟苯尼考使用的是外標法定量，即使氯霉素使用內(nèi)標法測定結(jié)果也是偏低，用水復(fù)溶效果不理想，改用1%甲酸乙腈、5%甲酸乙腈復(fù)溶，氯霉素和氟苯尼考的響應(yīng)值都得到改善，回收率也大大提高，5%甲酸乙腈溶解的標準品峰形更好，所以選擇5%甲酸乙腈作為復(fù)溶的試劑。

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