水豆豉是以大豆為原料，由芽孢桿菌、少量乳酸菌及酵母菌等微生物自然發(fā)酵獲得的中國傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品。水豆豉富含多種營養(yǎng)物質(zhì)，具有潛在的降血壓、降血脂、抗氧化等能力，產(chǎn)品豉香濃郁，風味獨特，深受消費者的喜愛。水豆豉與日本納豆同是細菌型豆豉的代表，兩者在原料、菌株、工藝等方面較為相似，納豆有很強的溶栓活性，被廣泛研究并作為改善血栓類疾病的功能食品而聞名世界。納豆及部分豆豉具有的溶栓活性主要來自于發(fā)酵過程中微生物生長代謝所產(chǎn)的纖溶酶類物質(zhì)。常見的產(chǎn)纖溶酶菌株主要是枯草芽孢桿菌。雖然解淀粉芽孢桿菌也具有產(chǎn)纖溶酶的能力，但是研究較多的是產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學特性等，尚未見用其純種發(fā)酵制備具有溶栓活性的水豆豉的報道。

目前，國內(nèi)外關(guān)于水豆豉的研究較少，且多集中于產(chǎn)品輔料配比和不同工藝流程對產(chǎn)品性質(zhì)的影響，對水豆豉的活性成分及功能的研究起步較晚。尹爽等研究不同工藝條件下水豆豉曲的氨基酸態(tài)氮、水分、總酸等理化指標的變化情況，并對加入的輔料用量進行優(yōu)化設計。劉佳慧等研究了制曲溫度、裝載量、制曲時間、生長因子添加量等對水豆豉曲氨基酸態(tài)氮含量的影響。馮霞等通過體外抗氧化試驗及動物實驗發(fā)現(xiàn)玻璃容器發(fā)酵的水豆豉比陶瓷和塑料容器發(fā)酵的水豆豉有更好的抗氧化效果。龐慶芳等發(fā)現(xiàn)不同微生物發(fā)酵的豆豉中細菌型豆豉的溶栓活性差異顯著，其中，自然發(fā)酵水豆豉的溶栓活性較低，純種發(fā)酵可能會提高產(chǎn)品的溶栓活性。

本課題組早期從豆豉樣品中篩選到1株產(chǎn)纖溶酶的解淀粉芽孢桿菌CAUnDJ118。本文用該菌株發(fā)酵大豆類原料（黃豆、黑豆、雙青豆）制備3種水豆豉，并研究其營養(yǎng)成分、溶栓及抗氧化活性，為進一步開發(fā)能改善心血管疾病的水豆豉功能食品提供試驗數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1. 1材料與試劑

1.1.1 材料

解淀粉芽孢桿菌CAUnDJ118，中國農(nóng)業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院酶工程實驗室篩選并保藏；黃豆、黑豆、雙青豆，產(chǎn)自黑龍江省齊齊哈爾市；辣椒粉、姜粉、食鹽，購于北京市美廉美超市學清路店。

1.1.2 試劑

凝血酶、纖維蛋白原、Gly-Leu、DPPH、ABTS、Trolox、TPTZ，美國SIgma公司；胰蛋白胨、酵母提取物，英國OxoId公司；蘆丁，上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸，上海麥克林公司；肝素鈉，北京拜爾迪公司；其它試劑無特別說明均為國產(chǎn)分析純級。

1.2 設備與儀器

全溫振蕩培養(yǎng)箱（HZQ-F160），太倉市豪城實驗儀器制造有限公司；立式壓力蒸汽滅菌鍋（TYAIB），寧波久興醫(yī)療器械有限公司；恒溫水浴鍋（DK-S24），上海精宏實驗設備有限公司；紫外可見分光光度計（TU-1800PC），北京普析通用儀器設備有限責任公司；酶標儀（ThermoMulTISkanFC），美國ThermoFISherSCIenTIFIC公司。

1.3 方法

1.3. 1種子液培養(yǎng)

將解淀粉芽孢桿菌CAUnDJ118在固體培養(yǎng)基上活化后，挑取1環(huán)接入液體種子培養(yǎng)基（0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%naCl，pH7.2～7.5），在37℃，200r/min下培養(yǎng)10h左右，當菌落數(shù)在109CFU/mL時作為種子液。

1.3.2 水豆豉的制作工藝細菌型水豆豉的制作工藝流程如下：

黃豆、雙青豆、黑豆→篩選→浸泡→蒸煮→接種→前酵→后熟→拌料→后酵→成品

選用顆粒飽滿、大小均勻、無蟲害霉變的黃豆、雙青豆、黑豆原料各100g，加入300mL蒸餾水于室溫下浸泡18h，浸泡后各類濕豆質(zhì)量約250g（濕豆質(zhì)量為干豆質(zhì)量的2.4～2.5倍為宜）。將浸泡結(jié)束后的豆子瀝水、分裝（直徑25Cm的玻璃平皿中裝200g濕豆原料），121℃蒸煮滅菌20mIn，冷卻后接入濕豆質(zhì)量5%的解淀粉芽孢桿菌CAUnDJ118種子液，于37℃培養(yǎng)24h，然后置于4℃后熟1d。將滅菌冷卻后的調(diào)料水（含5%食鹽、3%辣椒粉、3%姜粉）按濕豆質(zhì)量50%的添加量加入后熟完成的豆豉中，于45℃后發(fā)酵1d，獲得水豆豉成品。

未發(fā)酵水豆豉除在接種時將種子液替換成等量無菌水外，其余工藝與發(fā)酵水豆豉相同。

1.3.3 樣品處理及提取方法

將水豆豉成品放入真空冷凍干燥機中，冷凍干燥48～60h，粉碎過20目篩獲得水豆豉凍干粉樣品，密封保存于-20℃，備用。樣品待測液的制備方法如下：

水豆豉凍干粉水提液制備方法：稱取5.0g水豆豉凍干粉樣品，加入50mL蒸餾水，25℃，200r/mIn搖床浸提2h，10000r/mIn離心10mIn，收集上清液，獲得水豆豉樣品水提液。水提液中折合水豆豉樣品凍干粉含量為100mg/mL。
水豆豉凍干粉醇提液制備方法：稱取5.0g水豆豉凍干粉樣品，加入15mL體積分數(shù)80%甲醇，以480W功率超聲處理20mIn后，4000r/mIn離心10mIn獲得上清液。重復3次，合并上清液并將提取液體積定容50mL，獲得水豆豉樣品醇提液。醇提液中折合水豆豉凍干粉含量為100mg/mL。

1.4 活性測定方法

1.4.1 纖溶活性的測定

將1.4mL50mmol硼酸緩沖液、0.4mL0.72%纖維蛋白原溶液混勻后于37℃水浴鍋中預熱5mIn，加入0.1mL20U/mL凝血酶，混勻，在37℃下反應10mIn待其凝固。將水豆豉凍干粉水提液（100mg/mL）稀釋5倍，在反應體系中加入0.1mL水豆豉凍干粉水提液稀釋液（20mg/mL），混勻后于37℃下反應60mIn，每隔20mIn振蕩混勻1次。反應結(jié)束時立刻加入500μL0.2mol三氯乙酸溶液（TCA）終止反應，10000r/min離心10mIn，取上清液在275nm處測定吸光值。陰性對照的處理為先加終止劑TCA溶液，后加樣品稀釋液。酶活的定義：在上述條件下，與對照相比，測定時所用樣品稀釋液的吸光值每分鐘增加0.01相當于一個酶活單位，單位為FU/mL。根據(jù)水豆豉凍干粉水提液中折合水豆豉凍干粉質(zhì)量，將結(jié)果換算為FU/g。計算公式如下：

式中，x—樣品溶液的纖溶酶活力，F(xiàn)U/mL；A_r—樣品的吸光值；A_C—陰性對照的吸光值；60—反應時間60mIn，以1mIn計；0.1—反應的酶液體積是0.1mL；N—稀釋倍數(shù)。

1.4.2 抗凝血活性的測定

參考劉夢潔等的方法并稍作調(diào)整。纖維蛋白原、凝血酶均用凝血酶均用50mmolpH7.2的TrIS-HCl緩沖液（含0.12mmolnaCl）稀釋溶解。將水豆豉凍干粉水提液（100mg/mL）依次稀釋10，20，40，80，160，320，640倍獲得不同濃度的水豆豉凍干粉水提液稀釋液。在96孔板中加入140μL0.1%纖維蛋白原、40μL不同濃度的水豆豉凍干粉水提液稀釋液，置酶標儀中，在405nm處測定吸光值。5mIn后加入10μL12U/mL凝血酶，37℃反應10min后在405nm處測定吸光值。陽性對照為等量10mg/mL肝素鈉代替樣品?？瞻讓φ諡榈攘縏rIS-HCl緩沖液代替樣品。樣品的抗凝血活性按下式計算，根據(jù)樣品濃度與抗凝血活性的關(guān)系計算樣品的抗凝血活性IC₅₀值。

式中，x—某濃度樣品待測液的抗凝血活性百分比，%；A_c10min—反應10mIn后空白對照的吸光度；A_c5min—預熱5min后空白對照的吸光度；A_s10min—反應10mIn后樣品待測液的吸光度；A_s10min—預熱5mIn后樣品待測液的吸光度。

1.4.3 多肽含量的測定

采用鄰苯二甲醛法測定水豆豉的多肽含量，待測液為稀釋20倍的水豆豉凍干粉水提液（5mg/mL），用Gly-Leu二肽作為標準品制作標準曲線，單位為mg/mL，然后根據(jù)水豆豉凍干粉質(zhì)量，將結(jié)果換算為mg/g。

1.4.4 氨基酸態(tài)氮含量的測定

將部分未凍干處理的水豆豉樣品攪拌均勻后放入研缽中，在10mIn內(nèi)迅速研磨至無肉眼可見顆粒，裝入磨口瓶中備用。用已知質(zhì)量的稱量瓶稱取攪拌均勻的水豆豉樣品5.0g，用50mL80℃的蒸餾水分數(shù)次洗入100mL燒杯中，冷卻后轉(zhuǎn)入100mL容量瓶中，用少量水分次洗滌燒杯，將洗液并入容量瓶中定容100mL，混勻后過濾獲得水豆豉待測液。按照國家標準《食品中氨基酸態(tài)氮的測定》GB5009.235-2016酸度計法測定水豆豉的氨基酸態(tài)氮含量，單位為g/100g。

1.4.5 總酚含量的測定

采用福林（FolIn）-酚試劑法測定水豆豉的總酚含量，將水豆豉凍干粉醇提液（100mg/mL）稀釋10倍后作待測液，以沒食子酸作為標準品繪制標準曲線，單位為mgGAE/mL，根據(jù)水豆豉凍干粉質(zhì)量將結(jié)果換算為mgGAE/g。

1.4.6 總異黃酮含量的測定

參考Herald等的方法測定水豆豉的總異黃酮含量，將水豆豉凍干粉醇提液（100mg/mL）稀釋10倍后作待測液，以蘆丁為標準品制作標準曲線，單位為mgRE/mL，根據(jù)水豆豉凍干粉質(zhì)量將試驗結(jié)果換算為mgRE/g。

1.4.7 抗氧化活性的測定

參考DaI等和Gan等的方法測定水豆豉的DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力、FRAP還原能力。將水豆豉凍干粉醇提液（100mg/mL）分別稀釋適宜倍數(shù)，得到不同質(zhì)量濃度的稀釋液，測定并計算不同水豆豉凍干粉質(zhì)量濃度下的DPPH、ABTS清除率。

DPPH、ABTS清除率按下式計算，以Trolox作為標準品制作標準曲線，根據(jù)水豆豉凍干粉質(zhì)量，將結(jié)果用μmolTE/g表示。

水豆豉的FRAP還原能力測定以FeSO₄溶液制作標準曲線，換算還原力，待測液的FRAP還原能力單位為μmolFe²⁺/mL，根據(jù)待測液中折合水豆豉凍干粉質(zhì)量進行換算，結(jié)果以μmolFe²⁺/g表示。

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