2.5.2 轉(zhuǎn)148基因T1種子脂肪酸成分分析

分別收集野生型擬南芥(對照)、148基因過表達(35s-148)與RNAi干擾(148R)轉(zhuǎn)基因T1種子,烘干后用氣相色譜儀測定各脂肪酸含量,用Excel2019單因素方差分析法分析各個脂肪酸成分,結(jié)果見表6。

由表6可知,與野生型擬南芥種子脂肪酸各成分相比,干擾148基因(148R)會導(dǎo)致油酸含量增加,幅度為31.19%,而軟脂酸、亞麻酸會極顯著減少,而花生烯酸含量顯著減少,減少幅度分別為5.46%,18.68%,13.16%,并使硬脂酸增加,亞油酸和芥酸減少,但是增減幅度沒有達到顯著水平,干擾148基因還會導(dǎo)致芥酸含量增加；過表達148基因(35s-148)會導(dǎo)致軟脂酸、油酸、亞油酸含量的極顯著增加,其增加幅度分別為23.50%,45.12%，14.03%,而硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量與野生型擬南芥相比,都有極顯著的下降。

在對飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸分析中,干擾148基因會使飽和脂肪酸含量下降,對不飽和脂肪酸無顯著影響；過表達148基因會顯著增加不飽和脂肪酸的含量,而對飽和脂肪酸無顯著影響。

2.5.3 對具有相同變化趨勢的脂肪酸成分進行分析

結(jié)合表5,6,選取在2個拷貝基因的過表達與干擾體系中,脂肪酸成分具有相同變化趨勢的油酸、亞麻酸、花生烯酸和芥酸,并進行方差分析,結(jié)果見表7。

結(jié)果顯示,過表達114基因會導(dǎo)致花生烯酸極顯著的下降,而對其他脂肪酸含量無顯著影響；干擾148基因會導(dǎo)致芥酸含量的極顯著增加,而對其他脂肪酸成分無顯著影響。

3 討論與結(jié)論

棕櫚酸是游離脂肪酸中最主要的飽和脂肪酸,能夠誘導(dǎo)肝細胞、骨骼肌和心肌細胞等發(fā)生胰島素抵抗,硬脂酸是自然界廣泛存在的一種脂肪酸,在動物脂脈中的含量較高,植物油中含量較少,主要應(yīng)用于橡膠和化妝品工業(yè),人若長期微量攝入可能會刺激眼睛、呼吸系統(tǒng)。油酸是人體最易消化吸收的脂肪酸,高油酸具有降低人體血液中有害的低密度脂,同時可減少血漿中脂蛋白膽固醇含量,有效的預(yù)防及治療動脈的硬化。亞油酸是一種人體必需脂肪酸,在機體內(nèi)含量極為豐富,具有降血脂、降血壓、防止動脈硬化,還參與了人體物質(zhì)循環(huán)和免疫調(diào)節(jié)。x-亞麻酸是二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)的前體物質(zhì),EPA和DHA在視網(wǎng)膜和大腦的結(jié)構(gòu)膜中也起重要作用,亞麻酸還具有抗動脈粥樣硬化、預(yù)防心腦血管疾病及減肥、降血脂等生理功能?；ㄉ南┧峋哂性黾友軓椥?、酯化膽固醇,調(diào)節(jié)血細胞功能等一系列生理活性,對預(yù)防心血管疾病、糖尿病和腫瘤等具有重要功效?；ㄉ南┧峒捌浯x產(chǎn)物還參與了人體造血和免疫調(diào)節(jié),花生四烯酸降低血液中膽固醇的效果是亞油酸和亞麻酸的4倍,其降低血液中血脂和血壓的能力也要強于亞油酸和亞麻酸。芥酸在人體內(nèi)不易被消化吸收,而且芥酸凝固點高,不適于食品加工。高芥酸的油菜籽餅粕需經(jīng)過脫毒處理才能用作動物飼料,因此,降低芥酸含量是油菜食用目的脂肪酸改良的首要任務(wù)。

在西方飲食中,棕櫚酸(C16∶0)和硬脂酸(C18∶0)是最常食用得飽和脂肪酸。一般認為棕櫚酸比硬脂酸更能提高膽固醇,世界衛(wèi)生組織(WHO)與聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)曾建議食用油中飽和脂肪酸∶單不飽和脂肪酸∶多不飽和脂肪酸=1∶1∶1。熊秋芳等分析認為,在亞麻酸質(zhì)量分數(shù)不低于5%的前提下,飽和脂肪酸含量越低、油酸含量越高、且ω-6與ω-3比例為1～4∶1的天然食用植物油品最具營養(yǎng)價值。

擬南芥作為模式植物,并與甘藍型油菜同屬于蕓薹屬十字花科且有著共同的原始祖先,開展擬南芥研究可為甘藍型油菜研究提供重要參考與借鑒。

本研究對克隆得到的AT基因的2個拷貝進行生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)114與148同屬于?；D(zhuǎn)移酶模型,但其構(gòu)象略有不同，推測其在甘藍型油菜中發(fā)生了序列變異,將進一步研究；脂肪酸組成分析表明,乙酰轉(zhuǎn)移酶基因的這2個拷貝在飽和脂肪酸的代謝過程中具有相同的功能,過表達114基因與148基因均會導(dǎo)致軟脂酸含量的增加,硬脂酸含量的減少,干擾114基因與148基因均會導(dǎo)致軟脂酸含量的減少,硬脂酸含量增加,表明在軟脂酸向硬脂酸合成過程中發(fā)揮抑制作用，抑制這2個拷貝表達,可以促進軟脂酸向硬脂酸轉(zhuǎn)化；這2個拷貝在不飽和脂肪酸代謝過程中存在差異,過表達114基因和148基因均會引起亞油酸含量的增加，而通過分析其他幾個具有相同變化趨勢的脂肪酸成分后,發(fā)現(xiàn)可以通過過表達114基因,可以使花生烯酸含量顯著下降,干擾148基因的表達會導(dǎo)致芥酸含量的增加。這2個拷貝可以促進菜籽油品質(zhì)改良。

本研究以前期對高亞麻酸油菜近等基因系材料miRNA測序結(jié)果為基礎(chǔ),同源克隆獲得了AT基因的2個拷貝114與148(均為1350bp),分別構(gòu)建了這2個基因的翅表達載體和RNAi干擾載體并成功轉(zhuǎn)化擬南芥。生物信息學(xué)分析表明,114編碼的蛋白偏中性而148編碼的蛋白偏堿性,114與148均為穩(wěn)定蛋白,親水性差,屬于脂溶性蛋白，且定位在細胞質(zhì),無跨膜結(jié)構(gòu)。114基因與148基因在脂肪酸代謝途徑中,抑制軟脂酸向硬脂酸轉(zhuǎn)化。過表達114基因和與148基因可以提高不飽和脂肪酸含量,抑制這2個拷貝基因會導(dǎo)致飽和脂肪酸含量的增加；過表達114基因可以顯著增加軟脂酸、油酸和亞油酸的含量,并減少硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量,干擾114基因的表達可以增加硬脂酸和油酸的含量,減少軟脂酸、亞油酸和亞麻酸的含量；過表達148基因可以增加軟脂酸、油酸和亞油酸的含量，減少硬脂酸、亞麻酸和花生烯酸的含量,而干擾148基因會導(dǎo)致油酸、花生烯酸以及芥酸含量的增加,軟脂酸亞油酸和亞麻酸含量的減少；可以通過過表達114基因,促使花生烯酸含量的下降,干擾148基因的表達會導(dǎo)致芥酸含量的增加。因此,乙酰轉(zhuǎn)移酶基因這2個拷貝對改良甘藍型油菜脂肪酸成分作用明顯。

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