研制了液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)校準(zhǔn)用甲醇水中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并進(jìn)行不確定度評定。以咖啡因純品、色譜級甲醇和實驗室一級用水為原材料，利用質(zhì)量平衡法對咖啡因純品進(jìn)行純度核驗，利用基準(zhǔn)方法重量—容量法配制濃度9.94mg/L甲醇水中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。采用液相色譜法對9.94mg/L甲醇水中咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液和國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW(E)130453進(jìn)行量值比對，并對溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性、短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性進(jìn)行考察。結(jié)果表明研制的9.94mg/L的甲醇水中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性良好，相對擴(kuò)展不確定度為2%(k=2)，有效期為12個月。

0引言

咖啡因是一種中樞神經(jīng)興奮劑，同時也是國家管控的精神類藥品。人們偏愛含咖啡因成分的飲料，但是，大劑量或者長期飲用會對人體造成一定損害，基于它的成癮性和依賴性，一旦停用會出現(xiàn)緊張、煩躁、焦慮、心悸等癥狀。因此，咖啡因的檢測需要快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性較好的方法，以保證檢測量值的準(zhǔn)確性。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)具有特性量值的準(zhǔn)確性、均勻性、穩(wěn)定性等特點。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是溯源鏈的主要組成單元，也是化學(xué)計量的重要組成部分以及量值傳遞與溯源的重要手段之一。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被廣泛應(yīng)用在工業(yè)生產(chǎn)、商業(yè)貿(mào)易、環(huán)境保護(hù)、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域。通過使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來保存、復(fù)現(xiàn)和傳遞量值，進(jìn)而建立溯源性，以保證測量結(jié)果的一致性、可比性。

液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MS）廣泛應(yīng)用于石油化工、農(nóng)藥、食品和商品檢驗等領(lǐng)域。為了使分析結(jié)果能夠統(tǒng)一和溯源，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀應(yīng)按照國家校準(zhǔn)規(guī)范JJF1317-2011《液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀校準(zhǔn)規(guī)范》進(jìn)行校準(zhǔn)且儀器的各項性能指標(biāo)符合用戶的要求后方可使用。

本研究主要論述了甲醇水溶液中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究工作，詳細(xì)地介紹了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原材料的純度核驗方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法及定值測量、均勻性檢驗和穩(wěn)定性考察結(jié)果。從純品原料核驗、溶液配制、均勻性和穩(wěn)定性等環(huán)節(jié)對不確定度進(jìn)行分析，合成標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值的不確定度。對所得到的實驗結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果表明研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)性能良好，可望作為量值傳遞的標(biāo)準(zhǔn)，用于液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的校準(zhǔn)、分析方法評價以及質(zhì)量控制等。

1實驗部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀:UltiMate3000，具有紫外-可見光檢測器(VWD)、熒光檢測器(FLD)、二極管陣列檢測器（DAD,Thermo公司）；卡爾費(fèi)休水分分析儀：852,Metrohm公司；電子天平：XPE205DR/220g，瑞士梅特勒-托利多公司；電感耦合等離子質(zhì)譜儀：NexIONTM350X,PerkinElmer公司；容量瓶：100mL,1000mL,A級，經(jīng)檢定合格后使用；咖啡因的純度99.8%（標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)RM,U=0.2%,k=2）；甲醇:HPLC級，德國默克公司；超純水：實驗室制備的符合GB/T6682-2008規(guī)定中一級實驗用水，MiLLipore公司。

1.2甲醇水中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

1.2.1咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的預(yù)處理

在溶液配制前，將咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)置于P2O5干燥器中干燥48小時，除去水分。

1.2.2咖啡因純度核驗

采用質(zhì)量平衡法對咖啡因純品進(jìn)行純度核驗。主要成分含量采用高效液相色譜儀（峰面積歸一化法）計算咖啡因的純度。由于原材料咖啡因純品中含有少量水分和無機(jī)雜質(zhì)，無法用液相色譜法進(jìn)行分析。因此采用卡爾費(fèi)休水分分析儀（庫倫法）對咖啡因純品中水分含量進(jìn)行測定，無機(jī)元素含量則采用電感耦合等離子質(zhì)譜儀進(jìn)行測定。其主要定值原理如式(1)所示。

式中，P表示主成分純度，%；Pw表示水分含量，%；Pin表示無機(jī)元素含量，%；Ph表示液相色譜法峰面積歸一化測得的主成分含量，%。Pv表示揮發(fā)性有機(jī)物含量，%；

a.液相色譜儀測定主成分含量

首先對液相色譜分析方法進(jìn)行優(yōu)化。在液相色譜儀中，流動相和色譜柱是影響樣品分離效果的主要因素。GB5009.139-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中咖啡因的測定》是檢測食品中咖啡因現(xiàn)行有效的方法，本實驗參考該方法選用C18色譜柱，等度的方式，以流動相條件：甲醇-純水（24∶76,V/V）為基礎(chǔ)，進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過實驗分析，在1.0mL/min等度條件下，無法實現(xiàn)咖啡因主峰與干擾主要雜質(zhì)峰完全分離（如圖1）。因此采用以1.0mL/min的甲醇-純水（V/V）不同配比梯度洗脫優(yōu)化，最終選擇表1的梯度條件，在此條件下，咖啡因與主要雜質(zhì)峰完全分開，峰形對稱（如圖2）。

采用液相色譜法峰面積歸一化法的測定數(shù)據(jù)見表2。

b.咖啡因純品雜質(zhì)分析

采用卡爾費(fèi)休水分分析儀（庫倫法）測定咖啡因純品中的水分含量和采用ICP-MS對咖啡因純品中的70種無機(jī)元素含量進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，咖啡因純品原料中水分和70種無機(jī)元素雜質(zhì)總含量分別為0.078%和0.001%。采用頂空-氣相色譜儀（FID）未檢出咖啡因純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的揮發(fā)性溶劑殘留，以0%計。

c.咖啡因純度值的確定

咖啡因主成分Ph為99.88%，水分含量Pw為0.078%，無機(jī)元素組分Pin為0.001%，揮發(fā)性溶劑殘留Pv為0%，代入質(zhì)量平衡法公式（1）中計算咖啡因純度為99.8%。

d.純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度評定

根據(jù)JJF1006-1994一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范的規(guī)定，建立測量模型，分析不確定度來源，計算得到各個不確定度分量，將不確定度分量合成后得到相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，主要有均勻性、穩(wěn)定性和定值方法引入的不確定度。經(jīng)計算得到，質(zhì)量平衡法定值擴(kuò)展不確定度為Urel=0.2%,k=2。

1.3溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

采用重量-容量法制備咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在實驗室恒溫（20±3）℃條件下，精確稱9.962mg咖啡因標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(純度為99.8%)于潔凈的玻璃瓶中，用少量溶劑溶解后，轉(zhuǎn)入1000mL容量瓶中，再用甲醇水（80∶20,V/V）少量多次沖洗玻璃瓶，將每次的溶液轉(zhuǎn)入容量瓶中，最后用甲醇水（80∶20,V/V）定容至刻度，制備的甲醇水中咖啡因溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為9.94mg/L，充分搖勻靜置，隨后分裝于2mL安瓿瓶中，每瓶1mL，低溫保存。

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