目的：為滿足腸道集聚性大腸埃希氏菌準(zhǔn)確檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證需求，研制具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)且具有全基因組測(cè)序信息的均勻穩(wěn)定的腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體及gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。方法：利用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)腸道集聚性大腸埃希氏菌（CMCC44841）進(jìn)行全基因組測(cè)序，明確CMCC44841的種屬、血清分型、多位點(diǎn)序列分型和毒力基因。對(duì)CMCC44841進(jìn)行astA、aggR、pic特征性基因PCR確認(rèn)。采用冷凍干燥技術(shù)制備含量為103CFU/樣品的菌球和含量為20ng/樣品的gDNA小球。參照CNAS-GL017對(duì)20個(gè)菌球樣品進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)，采用單因素方差分析對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。將樣品分別于-20℃、4℃、25℃和37℃條件下保藏，對(duì)其儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和運(yùn)輸穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)。組織3家實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行協(xié)同標(biāo)定和驗(yàn)證。使用5種不同基質(zhì)的即食食品樣本，按照國(guó)標(biāo)法檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的適用性。結(jié)果：利用生物信息學(xué)分析，CMCC44841基因組大小為5.057285Mb，GC含量為50.6%，編碼區(qū)基因5173個(gè)。種屬鑒定結(jié)果為大腸埃希氏菌（Escherichiacoli），血清預(yù)測(cè)結(jié)果為O127:H21，MLST為ST40型，攜帶除aggR、astA、pic之外其他相關(guān)的毒力基因。PCR擴(kuò)增出astA、aggR、pic片段大小分別為102bp、400bp和1111bp。菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)結(jié)果F=1.59，符合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的要求。菌體和gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品于-20℃和4℃保藏60d，25℃保藏7d，37℃保藏5d后仍然穩(wěn)定。經(jīng)3家實(shí)驗(yàn)室協(xié)同標(biāo)定，菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品含量均為103CFU/樣品。20件不同基質(zhì)的食品樣品加入腸道集聚性大腸埃希氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行檢驗(yàn)，均可以檢出。結(jié)論：本研究所制備的腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體及gDNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所用菌株來(lái)源于我國(guó)國(guó)內(nèi)分離菌株，且具有明確的全基因組序列信息，均勻性和穩(wěn)定性均符合要求，適用性良好，能夠滿足食品檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量控制和能力驗(yàn)證的需求。

致瀉性大腸埃希氏菌所引起的腹瀉是世界范圍內(nèi)存在的一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題。根據(jù)毒力因子、致病機(jī)理和流行病學(xué)特征，致瀉性大腸埃希氏菌可分為5類：腸道致病性大腸埃希氏菌（enteropathogenic Escherichiacoli,EPEC）、腸道產(chǎn)毒性大腸埃希氏菌（enterotoxigenic Escherichiacoli,ETEC）、腸道出血性大腸埃希氏菌（enterohemorrhagic Escherichiacoli,EHEC）、腸道侵襲性大腸埃希氏菌（enteroinvasive Escherichiacoli,EIEC）以及腸道集聚性大腸埃希氏菌（Enteroaggregative Escherichiacoli,EAEC）。EAEC是一類新發(fā)現(xiàn)的致瀉性大腸埃希氏菌，已在世界各國(guó)引起散發(fā)或暴發(fā)。美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院已將EAEC歸為B類生物恐怖病原體。我國(guó)各省市致瀉大腸埃希氏菌流行特征分析結(jié)果顯示，EAEC在食源性致瀉大腸埃希氏菌中最常見(jiàn)，為主要毒力基因型。因此食品中EAEC快速準(zhǔn)確的檢測(cè)工作對(duì)預(yù)防和控制由其引起的細(xì)菌性食物中毒事件有著非常重要的作用。

EAEC傳統(tǒng)的鑒定方法包括分離培養(yǎng)、生化鑒定、血清學(xué)鑒定和16SrDNA鑒定等，這些方法實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，且存在一定的局限性。目前PCR技術(shù)由于其靈敏度高可靠性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于EAEC的檢測(cè)中。國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.6-2016規(guī)定對(duì)生化反應(yīng)符合大腸埃希氏菌特征的菌落進(jìn)行集聚熱穩(wěn)定性毒素A基因（enteroag gregative heat-stable enter otoxin A,astA）、集聚黏附菌毛調(diào)節(jié)基因（aggregative adhesive fimbriaere gulator,aggR）、腸定植因子基因（proteininvolve dinintestinal colonization,pic）三個(gè)特征性基因的PCR鑒定，每次PCR反應(yīng)需要使用EAEC標(biāo)準(zhǔn)菌株及其gDNA作為陽(yáng)性對(duì)照，以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于復(fù)雜的食品基質(zhì)背景、培養(yǎng)基、試劑、DNA提取、人員操作等原因可直接影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，所以在檢測(cè)過(guò)程中需要穩(wěn)定的微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和DNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)整個(gè)檢驗(yàn)過(guò)程進(jìn)行質(zhì)量控制，從而保證檢測(cè)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和有效性。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于EAEC菌體標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其基因組DNA（genomic DNA，gDNA）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并未見(jiàn)相關(guān)的研究報(bào)道。

自21世紀(jì)初，基因測(cè)序技術(shù)取得突破性進(jìn)展，基因測(cè)序獲得的數(shù)據(jù)量、測(cè)序速度和費(fèi)用都得到大幅度改觀。在國(guó)內(nèi)，單個(gè)微生物基因組測(cè)序的費(fèi)用也從數(shù)萬(wàn)元降低至目前幾百元。通過(guò)對(duì)食源性微生物基因組進(jìn)行測(cè)序、組裝，能夠獲得90%以上的細(xì)菌DNA信息，包括種屬、耐藥基因、毒力因子、轉(zhuǎn)移元件等信息，可對(duì)多個(gè)細(xì)菌間的基因組信息進(jìn)行比對(duì)分析，在細(xì)菌鑒定、耐藥機(jī)制和溯源等研究中發(fā)揮重要的作用。

本研究針對(duì)目前檢驗(yàn)領(lǐng)域需求，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)腸道集聚性大腸埃希氏菌CMCC44841進(jìn)行全基因組測(cè)序，研制基因組信息背景清晰、穩(wěn)定性良好的即用型腸道集聚性大腸埃希氏菌菌體和gDNA兩種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，不僅能夠應(yīng)用于食品檢測(cè)機(jī)構(gòu)的質(zhì)量控制和人員考核，而且可為我國(guó)食品安全檢測(cè)水平進(jìn)一步提高、及時(shí)發(fā)現(xiàn)問(wèn)題提供有力的技術(shù)支撐。

1材料與方法

1.1材料與試劑

腸道集聚性大腸埃希氏菌（EAEC）CMCC44841來(lái)源于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心。

胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptosesoyaagar,TSA）美國(guó)BD公司；生理鹽水國(guó)藥集團(tuán)；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（DP302）天根生化科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP日本Takara；瓊脂糖Oxoid。

1.2儀器與設(shè)備

FreeZone12L冷凍干燥機(jī)德國(guó)LABCONCO公司；PL2002電子天平瑞士梅特勒-托利多公司；Thermo1389生物安全柜、205050GC恒溫培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、NanoDrop2000微量核酸蛋白測(cè)定儀、Qubit熒光定量測(cè)定儀美國(guó)Thermo公司；FORMA恒溫?fù)u床西班牙IUL公司；VITEKCompact2自動(dòng)微生物分析系統(tǒng)法國(guó)梅里埃公司；Autoflex飛行質(zhì)譜德國(guó)Bruker公司；C1000PCR儀、紫外凝膠成像系統(tǒng)美國(guó)伯樂(lè)公司。

相關(guān)鏈接：大腸埃希氏菌，毒素，聚合酶，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

聲明：本文所用圖片、文字來(lái)源《食品科學(xué)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系刪除。