黃酒是我國的傳統(tǒng)特產(chǎn)，主要以谷物為原料，加入麥曲、酵母等進行發(fā)酵而成。黃酒發(fā)酵環(huán)境開放，在釀造過程中微生物群落結(jié)構(gòu)復雜，含有各種霉菌、細菌及酵母，且釀造過程中產(chǎn)生的各種酶類，能夠降解大分子物質(zhì)，促進黃酒風味物質(zhì)的代謝合成，賦予黃酒豐富的營養(yǎng)成分和獨特的風味。因此，對黃酒釀造過程中微生物組成進行系統(tǒng)性研究，有利于深入了解黃酒發(fā)酵機理，對實現(xiàn)黃酒產(chǎn)業(yè)的高品質(zhì)和健康發(fā)展具有重要意義。

早在1904年，日本學者就對紹興黃酒釀造中的微生物多樣性展開了研究，至今已有百余年。起初對微生物多樣性的研究主要采用傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)，該技術(shù)操作簡單且可直接獲得分離出的目標微生物，是分析微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性最基本的方法。但是，該方法工作量大，且僅能夠篩選出少量微生物，大部分微生物因不能培養(yǎng)而遺漏，造成檢測的微生物群落結(jié)構(gòu)不準確。隨著現(xiàn)代分子技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究人員開始采用非培養(yǎng)技術(shù)來研究復雜環(huán)境體系中的微生物群落。高通量測序技術(shù)作為一項全新的測序技術(shù)，能夠平行、全面地分析不同樣本的群落結(jié)構(gòu)，具有通量高、測序速度快、數(shù)據(jù)準確等優(yōu)點，已被廣泛應用于各種微生物系統(tǒng)多樣性的檢測和研究中。近年來，高通量測序技術(shù)也逐漸被應用到傳統(tǒng)發(fā)酵食品中微生物多樣性的研究，如奶酪、白酒、黃酒和泡菜等。本文在介紹高通量測序技術(shù)的基礎上，分析其在黃酒微生物多樣性研究中的應用情況，旨在為黃酒發(fā)酵機理及品質(zhì)調(diào)控等相關(guān)領域的深入研究提供理論指導。

1高通量測序技術(shù)簡介

高通量測序（HighThroughputSequencing,HTS）又稱為下一代測序技術(shù)（NextGenerationSequencing,NGS），是基因測序領域的一大革命性創(chuàng)新，極大地拓寬了環(huán)境微生物分析的領域。該技術(shù)使用通用接頭，與片段基因組DNA相連接，隨后使用不同的方法實現(xiàn)PCR拷貝。之后可同時大規(guī)模地進行引物雜交和酶的延伸反應，實現(xiàn)對幾十萬至幾百萬條DNA分子的序列測定，同時檢測每一步反應產(chǎn)生的信號，由此獲取測序數(shù)據(jù)，最終通過計算機分析獲取完整DNA信息。根據(jù)其原理不同，可分為聚合酶合成測序和連接酶合成測序兩類。通常，高通量測序平臺主要包括Roche454焦磷酸測序平臺、Illumina測序平臺、ABISOLiD測序平臺、IonTorrent測序平臺和PacBioSMRT測序平臺等。其中，Roche454和Illumina測序平臺是目前應用最廣泛的測序平臺。

1.1Roche454測序平臺

Roche454測序平臺是以4種酶（DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、熒光素酶和雙磷酸酶）為核心的催化酶級聯(lián)反應，以5’-磷酰硫酸和熒光素為底物，加入待測DNA單鏈和引物的總體系。在退火過程后，利用上述4種酶的協(xié)同作用，將dNTP的延伸和與之相對應的熒光信號的釋放偶聯(lián)起來，通過檢測熒光信號的強度，達到實時記錄DNA序列的目的。該測序平臺的優(yōu)點是測序讀長較長、耗時短，但也存在著成本較高，樣本制備復雜等劣。

1.2Illumina測序平臺

Illumina測序平臺的基本原理為單分子簇邊合成邊測序和dNTP可逆終止化學反應。首先將基因組DNA處理成單鏈狀態(tài)，單鏈DNA在固相的表面經(jīng)過橋式擴增，形成單分子簇，用作測序模板。后續(xù)反應中，加入熒光可逆終止子dNTP，由于dNTP3’端有識別的切割位置，每個循環(huán)只增加單個堿基。將不同堿基上的熒光標記所激發(fā)的不同的信號進行捕獲，從而得知模板DNA的序列。Illumina在二代測序中通量最高，測序成本最低，但其讀長較短。

1.3ABISOLID測序技術(shù)

ABISOLID測序技術(shù)核心是4種熒光標記寡核苷酸的連接反應測序，其基本原理為通過乳液PCR和磁珠富集形成文庫，與Roche454的原理基本相同。隨后進行多輪測序反應和每輪多次連接反應，連接測序所用的底物是8個堿基熒光探針混合物，根據(jù)序列的位置，樣品DNA即可被探針標記。DNA連接酶優(yōu)先連接和模板配對的探針，并引發(fā)該位點的熒光信號的產(chǎn)生。并且每個位點實現(xiàn)2次掃描，使得準確率可達99.94%。SOLID在測序通量和精準度上優(yōu)勢明顯，但也存在讀長短、成本高等劣勢。

1.4IonTorrent

IonTorrent在2011年被《Nature》所報道，是第一個不需要光學系統(tǒng)的，使用半導體芯片在化學和數(shù)字信息之間建立直接的聯(lián)系的技術(shù)，被稱為介于第二代和第三代之間的測序平臺。其原理為，在半導體芯片的微孔中固定DNA鏈，隨后依次摻入A、T、C及G。通過檢測堿基配對時，氫離子的釋放引起pH的變化，利用芯片將化學信號轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號，從而讀出DNA序列。該技術(shù)操作簡單、成本低、耗時短，但也存在通量較低的缺點。

2高通量測序技術(shù)在黃酒微生物多樣性分析中的應用

多種微生物混菌發(fā)酵是黃酒釀造的最大特點，發(fā)酵過程中各個環(huán)節(jié)都會帶入種類不同的微生物。通過對其中微生物多樣性的檢測，能夠為黃酒酵造工藝的改良提供理論指導。近些年，許多學者將高通量測序技術(shù)應用于黃酒微生物多樣性的研究。本文將對研究者們利用高通量測序平臺，對黃酒釀造的不同工藝流程中微生物多樣性的研究結(jié)果進行歸納。

2.1浸米水中微生物多樣性分析

浸米是黃酒釀造的首道工序，也是重要的工藝流程之一。通過浸米過程，讓大米吸足水分便于蒸煮，以保障發(fā)酵的順利進行與風味產(chǎn)生。浸米水中微生物種類豐富，大量的微生物及其代謝產(chǎn)物對黃酒的風味和品質(zhì)有重要影響。朱小芳等通過Illumina高通量測序技術(shù)，對上海金楓酒業(yè)股份有限公司提供的浸米水中細菌群落結(jié)構(gòu)進行分析。結(jié)果顯示，乳酸菌屬、片球菌屬、醋酸菌屬和不動桿菌屬為浸米水中的主要微生物，其中乳酸菌屬豐度含量可達60.67%，乳酸菌屬中57.4%為植物乳桿菌，21.1%為短乳桿菌。在浸米過程中，這些乳酸菌不僅能分解淀粉、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)，供給酵母發(fā)酵產(chǎn)酒精，還會自溶分解為多肽、少量氨基酸和其他成分，促進黃酒的呈香呈味，增強黃酒口味的豐滿性和濃厚感。

2.2麥曲微生物多樣性分析

麥曲是黃酒釀造中的重要原料，由原麥自發(fā)發(fā)酵而成。麥曲微生物群落較為復雜，含有各種霉菌、細菌及酵母，是黃酒發(fā)酵中微生物最重要的來源，這些微生物很大程度上決定了黃酒的風味、口感。

目前，已有較多學者利用高通量測序技術(shù)對麥曲中真菌群落結(jié)構(gòu)進行研究。從研究結(jié)果來看，麥曲中真菌主要為根霉菌、曲霉菌、毛霉菌和鐮刀菌。另外，細菌在黃酒發(fā)酵過程中發(fā)揮著同樣重要的作用，因此對麥曲中細菌的群落結(jié)構(gòu)進行分析是準確闡述黃酒發(fā)酵微生物作用機制的前提，對提高麥曲及黃酒品質(zhì)有重要意義。利用高通量測序技術(shù)分析麥曲中細菌結(jié)構(gòu)已有一定研究，發(fā)現(xiàn)細菌中的優(yōu)勢菌群普遍以芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬和糖多孢菌屬為主。但是，由于年份、產(chǎn)地以及處理環(huán)境的不同，檢測出的優(yōu)勢菌種存在一定差異，統(tǒng)計結(jié)果見表1。

2.3黃酒發(fā)酵過程中微生物群落變化分析

黃酒發(fā)酵是決定釀造品質(zhì)極為關(guān)鍵的一環(huán)。發(fā)酵過程中，微生物種類豐富，代謝活躍，發(fā)酵液中酒精濃度上升、氧氣含量下降以及多種微生物代謝產(chǎn)物的大量累積，使得微生物結(jié)構(gòu)也在發(fā)生明顯的變化。目前研究者們普遍認為，黃酒中風味物質(zhì)主要是由原料投入和微生物發(fā)酵所產(chǎn)生，因此對于黃酒發(fā)酵過程中微生物動態(tài)變化的研究尤為重要。發(fā)酵的整個過程分為前發(fā)酵時期和后發(fā)酵時期，期間群落組成的快速變化，使得傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)方式不能及時測定某一時刻微生物的群落結(jié)構(gòu)，同時還會出現(xiàn)大量微生物因無法培養(yǎng)而被遺漏的情況。分子生物學技術(shù)的快速發(fā)展，為環(huán)境中微生物的解析帶來了極大的便利，尤其是高通量測序技術(shù)的利用，能夠高效地對發(fā)酵過程中微生物群落的動態(tài)變化進行監(jiān)測。

在基于高通量測序的黃酒發(fā)酵過程中微生物群落變化分析中總結(jié)發(fā)現(xiàn)，細菌的優(yōu)勢菌群為糖多孢菌屬、芽孢桿菌屬和葡萄球菌屬，而FANGRuosi等所檢測出的泛菌屬并未在其他報告中有所顯示；真菌的優(yōu)勢菌群普遍為曲霉屬微生物，劉蕓雅研究報告中指出其相對豐度最高，達到84.00%～98.95%，同樣在牟穰的報告中，曲霉菌的相對豐度從第0d的95.09%上升到第24d的99.67%，可見曲霉菌在釀酒過程的真菌菌群中占絕對的優(yōu)勢。同時將多項研究對比發(fā)現(xiàn)，黃酒發(fā)酵液中微生物多樣豐富，發(fā)酵過程中微生物多樣性整體呈下降趨勢，并且不同類群的豐度變化情況也呈現(xiàn)多樣性。詳細數(shù)據(jù)對比如表2所示。

2.4陳釀過程中微生物分析

陳釀是優(yōu)質(zhì)黃酒生產(chǎn)中必不可少的工藝環(huán)節(jié)，素有“酒是陳的香”的說法。新釀成的黃酒，營養(yǎng)物質(zhì)豐富卻不穩(wěn)定，在貯存陳釀過程中常出現(xiàn)酸敗變質(zhì)的現(xiàn)象，從而對黃酒產(chǎn)業(yè)造成較大的經(jīng)濟損失。近些年，研究者通過高通量測序手段對黃酒酸敗的關(guān)鍵微生物進行解析，為黃酒陳釀過程中酸敗微生物的控制提供了可靠的理論依據(jù)。劉文容等利用IlluminaMiSeq技術(shù)對分離的微生物進行16SrRNA鑒定，結(jié)果顯示細菌的優(yōu)勢菌群為乳酸桿菌屬，并確定出絕對優(yōu)勢微生物為耐酸乳桿菌或食果糖乳桿菌。將這兩種微生物進行全基因組對比，鑒別出的36株待測微生物中包括28株耐酸乳桿菌和8株食果糖乳桿菌，均可使黃酒總酸含量升高，其中耐酸乳桿菌產(chǎn)生的影響更大。對于難培養(yǎng)微生物的快速分析，高通量測序技術(shù)無疑提供了一個有效的解決途徑。通過這種技術(shù)，能夠準確且高效地檢測微生物的種類。

3結(jié)語

近年來黃酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展緩慢，黃酒釀造工藝和風味的創(chuàng)新與改良也需要更多專業(yè)的研究成果指引。相較于白酒、葡萄酒微生物的研究，我國在黃酒微生物上的研究相差甚遠。黃酒釀造過程的微生物群落呈現(xiàn)出動態(tài)的變化，傳統(tǒng)的方式在篩選、培養(yǎng)和操作上有很大的局限性。得益于高通量測序技術(shù)在檢測微生物多樣性中的應用，該方面的研究在時間、成本和準確性等方面有了明顯的改觀，大大地減少了不必要的耗費，并且能夠更全面地構(gòu)建微生物群落體系。同時，隨著第三代測序技術(shù)的逐漸發(fā)展，高通量技術(shù)在測序時間和測序長度上有著明顯的提升，相信也將逐步應用于黃酒微生物多樣性的研究之中，為我國黃酒產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展提供更多的理論指導。

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