3.1.2 最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證

最低檢測(cè)限的確定及驗(yàn)證是評(píng)價(jià)產(chǎn)品性能的重要環(huán)節(jié)。因目前新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑國家參考品均無量值定值，故企業(yè)在研發(fā)過程中無法通過國家參考品進(jìn)行量值溯源，這就需要企業(yè)對(duì)最低檢測(cè)限進(jìn)行合理設(shè)定及驗(yàn)證。在進(jìn)行最低檢測(cè)限的確定時(shí)，應(yīng)至少包含不同來源的三個(gè)具有代表性的2019新型冠狀病毒的真實(shí)臨床樣本或含有該病毒RNA片段的假病毒顆粒，用適當(dāng)基質(zhì)進(jìn)行系列梯度稀釋，在最低檢測(cè)限濃度水平進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果應(yīng)達(dá)到90%～95%陽性檢出率。采用科學(xué)的方法標(biāo)定病毒滴度，進(jìn)行最低檢測(cè)限相關(guān)的量值研究，并且提供詳細(xì)的病毒液滴度的驗(yàn)證結(jié)果。

3.1.3 交叉反應(yīng)驗(yàn)證

交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)可以直接反應(yīng)出試劑特異性方面的性能，特異性高的試劑可以減少假陽性樣本的出現(xiàn)。試劑需在病毒和細(xì)菌感染的醫(yī)學(xué)相關(guān)水平進(jìn)行交叉反應(yīng)的驗(yàn)證。《核酸審評(píng)要點(diǎn)》中列舉了約50余種病毒和細(xì)菌種類，企業(yè)如無法獲得全部種類的樣本，建議至少在冠狀病毒（HKU1、OC43、NL43、229E）、SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒、流感病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、腺病毒等7個(gè)大類別中分別挑選代表病毒或細(xì)菌樣本進(jìn)行驗(yàn)證。其中對(duì)于難以獲得真實(shí)樣本的類型，如SARS、MERS可用假病毒替代。需提供所有用于交叉反應(yīng)驗(yàn)證的病毒和細(xì)菌的來源、種屬/型別和濃度確認(rèn)等相關(guān)資料。

3.1.4 精密度檢測(cè)方法

《核酸審評(píng)要點(diǎn)》中要求精密度性能驗(yàn)證需要多個(gè)臨床樣本，除模擬樣本外，同時(shí)應(yīng)包含若干臨床樣本，至少包含陰性樣品、臨界陽性樣品、（中或強(qiáng)）陽性樣品。精密度評(píng)價(jià)試驗(yàn)及注冊(cè)檢驗(yàn)過程中應(yīng)包含核酸分離/純化步驟。重復(fù)性參考品中應(yīng)包括高、低兩個(gè)濃度的樣本，其中低濃度應(yīng)為最低檢出限附近的濃度。

3.1.5 企業(yè)參考品的設(shè)置與制備

2020年4月16日，中國食品藥品檢定研究院標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)化管理中心發(fā)布了《注冊(cè)檢驗(yàn)用體外診斷試劑國家標(biāo)準(zhǔn)品和參考品目錄（第八期）》，目錄中增加了6個(gè)新型冠狀病毒抗體、抗原及核酸檢測(cè)試劑相關(guān)的國家參考品，此批應(yīng)急用國家參考品可用于評(píng)估各申報(bào)試劑的性能，但沒有公布量值及計(jì)量溯源。

各企業(yè)應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品性能的實(shí)際情況，同時(shí)參照中國食品藥品檢定研究院的新型冠狀病毒核酸檢測(cè)試劑國家參考品設(shè)置企業(yè)內(nèi)部參考品的項(xiàng)目及內(nèi)容，包括陽性參考品、陰性參考品、檢測(cè)限參考品、重復(fù)性參考品，且應(yīng)不低于國家參考品要求。其中，陽性參考品應(yīng)至少選取不同來源、不同滴度水平的5個(gè)病毒樣本。陰性參考品則主要包含對(duì)交叉反應(yīng)進(jìn)行驗(yàn)證的樣本。檢測(cè)限參考品的濃度水平可等于或略高于最低檢測(cè)限的水平。企業(yè)應(yīng)對(duì)內(nèi)部參考品的來源、型別鑒定、病毒滴度等信息進(jìn)行精確的試驗(yàn)驗(yàn)證，并提交詳細(xì)的方法、使用試劑、具體數(shù)據(jù)結(jié)果等驗(yàn)證資料。除SARS冠狀病毒、MERS冠狀病毒可采用假病毒外，參考品應(yīng)均為臨床真實(shí)樣本。

3.1.6 不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗(yàn)證

目前有多種樣本類型，拭子材質(zhì)、采集方法、樣本采集量和采樣時(shí)機(jī)等都與病毒載量密切相關(guān)，可直接影響到試劑的檢出率?！对\療方案第七版》中，明確病原學(xué)檢查樣本包括：鼻咽拭子、血液、痰和其他下呼吸道分泌物、糞便等標(biāo)本[1]?！缎滦凸跔畈《靖腥镜姆窝讓?shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》中將標(biāo)本采集種類做了進(jìn)一步的細(xì)化，包括鼻咽拭子、鼻咽抽取物、呼吸道抽取物、深咳痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液、肺組織活檢標(biāo)本、眼結(jié)膜拭子及便標(biāo)本，并對(duì)不同類型的樣本分別有相應(yīng)的采集及保存要求[6]。2020年7月21日，國務(wù)院應(yīng)對(duì)新型冠狀病毒肺炎疫情聯(lián)防聯(lián)控機(jī)制醫(yī)療救治組發(fā)布了《新冠病毒核酸篩查稀釋混樣檢測(cè)》中，規(guī)定原則上不超過5個(gè)的咽拭子進(jìn)行充分混合，形成混合待檢樣本。面對(duì)種類眾多的樣本類型，且包括混合樣品，這就需要企業(yè)對(duì)于上述所有樣本類型的核酸提取試劑/方法的提取效率、提取純度等，有針對(duì)性地對(duì)樣本的滅活/液化、加樣體積和模板洗脫體積做研究驗(yàn)證，明確說明具體操作過程，并提供詳細(xì)的驗(yàn)證資料。若提取過程中涉及配套使用的自動(dòng)核酸提取儀，企業(yè)還需要提供核酸提取儀的相關(guān)注冊(cè)證書、儀器使用說明書及配套提取試劑盒的使用說明書。從而確保檢測(cè)體系具有可控性，提高試劑靈敏度，降低假陰性結(jié)果的出現(xiàn)，保證檢測(cè)過程順利進(jìn)行。

3.2 抗體檢測(cè)試劑性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

抗體檢測(cè)質(zhì)量控制要點(diǎn)與核酸檢測(cè)基本一致，但考慮抗體檢驗(yàn)容易受到樣本溶血、纖維蛋白、細(xì)菌污染或患者自身抗體等因素的影響，容易造成假陽性。因此，內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾驗(yàn)證及血液樣本滅活方式對(duì)試劑的影響也需要企業(yè)進(jìn)行合理驗(yàn)證。據(jù)薛雄燕等[7]報(bào)道，采用熒光免疫分析法檢測(cè)SARS-Co V-Ig M，滅活前結(jié)果為陰性的標(biāo)本，滅活處理后所有檢測(cè)結(jié)果均為陽性，陰性符合率為0，表明此方法不可采用56℃、30min滅活處理后的樣本進(jìn)行檢測(cè)。說明不同的滅活方法會(huì)影響抗體檢測(cè)結(jié)果，企業(yè)應(yīng)在試劑說明書中寫明樣本滅活方法，并加以驗(yàn)證。對(duì)于同時(shí)可檢測(cè)Ig M、Ig G兩種抗體的檢測(cè)試劑盒，企業(yè)陽性參考品制備時(shí)要注意合理均勻分配兩種抗體陽性樣本的比例，且應(yīng)包含有Ig M、Ig G兩種抗體陽性的樣本，也包含有Ig M、Ig G單獨(dú)抗體陽性的樣本。

4 建議

2019新型冠狀病毒肺炎疫情的突發(fā)是對(duì)企業(yè)的研發(fā)能力、生產(chǎn)能力的一場(chǎng)巨大考驗(yàn)，也是對(duì)臨床實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)能力、安全防范的一次極大挑戰(zhàn)。疫情在全球范圍內(nèi)蔓延造成了對(duì)SARS-Co V-2檢測(cè)試劑的巨大需求，研發(fā)生產(chǎn)出更加快速、便捷、準(zhǔn)確的SARS-Co V-2檢測(cè)試劑成為各個(gè)廠家研發(fā)的目標(biāo)。疫情初期，對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽性、假陰性的質(zhì)疑聲不絕于耳，但檢測(cè)過程中的各個(gè)環(huán)節(jié)都會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度，如：試劑質(zhì)量、采用方式、樣品質(zhì)量、操作人員、儀器性能等。應(yīng)急研發(fā)生產(chǎn)的試劑在質(zhì)量方面可能存在差異，仍有待進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證及比對(duì)。但各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)根據(jù)自身具體情況，制定建立完整、合理和科學(xué)的技術(shù)操作規(guī)程、生物安全防護(hù)管理制度、結(jié)果質(zhì)量保證措施及結(jié)果報(bào)告的規(guī)范等，同時(shí)應(yīng)對(duì)檢測(cè)人員進(jìn)行嚴(yán)格的培訓(xùn)與考核。各個(gè)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)針對(duì)不同儀器、人員、方法和試劑開展室間質(zhì)評(píng)實(shí)驗(yàn)比對(duì)活動(dòng)，確保最終結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，以便更好地指導(dǎo)臨床診療工作。在注冊(cè)檢驗(yàn)及審批過程中應(yīng)加強(qiáng)質(zhì)量把控，保證檢驗(yàn)質(zhì)量，提高檢驗(yàn)效率，確保檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，從而確保上市產(chǎn)品的質(zhì)量。隨著技術(shù)的發(fā)展與研究的深入，病毒檢測(cè)技術(shù)與方法日趨成熟完善，SARS-Co V-2檢測(cè)試劑會(huì)更好地服務(wù)于臨床，為做好常態(tài)化疫情防控工作提供強(qiáng)有力技術(shù)支撐。

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