引言

2019年12月以來，湖北省武漢市出現(xiàn)新型冠狀病毒肺炎疫情，隨疫情蔓延，我國其他地區(qū)及境外多個(gè)國家也相繼發(fā)現(xiàn)此類病例。該病作為急性呼吸道傳染病已納入《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的乙類傳染病，按甲類傳染病管理。2020年2月11日，世界衛(wèi)生組織將新型冠狀病毒肺炎命名為COVID-19，國際病毒分類學(xué)委員會(huì)的冠狀病毒研究小組建議把新型冠狀病毒命名為SARS-Co V-2（嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒）。新型冠狀病毒屬于b屬的冠狀病毒，基因組為線性的單股正鏈RNA，是已知可感染人類的第7種冠狀病毒，有包膜，顆粒呈圓形或橢圓形，常為多形性，直徑60～140 nm?？梢鹑祟惡粑栏腥?，其基因特征與嚴(yán)重急性呼吸綜合征（SARS）相關(guān)冠狀病毒和中東呼吸綜合征(MERS)相關(guān)冠狀病毒有明顯區(qū)別，基因組序列約由29 kb堿基對構(gòu)成，擁有10個(gè)基因，可有效編碼10個(gè)蛋白。此次由SARS-Co V-2引起COVID-19疫情具有傳染性強(qiáng)、傳播迅速等特點(diǎn)，對該病毒進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室檢測有利于有效控制疫情發(fā)展及對病患的及時(shí)診治。疫情爆發(fā)以來，由于時(shí)間緊迫，研發(fā)任務(wù)緊急，已上市的產(chǎn)品存在質(zhì)量上的不足。為提升試劑產(chǎn)品的性能，以便其更好地在疫情防控中發(fā)揮作用，本研究結(jié)合注冊檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的問題，從檢驗(yàn)角度著重分析可能影響產(chǎn)品性能和質(zhì)量的把控要點(diǎn)，并提出相關(guān)建議，為今后SARS-Co V-2實(shí)驗(yàn)室檢測試劑的研發(fā)工作提供參考與思路。

1 新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測方法

目前，針對新型冠狀病毒肺炎的實(shí)驗(yàn)室檢測方法主要分為病原學(xué)方法及血清學(xué)方法。病原學(xué)檢測主要為核酸檢測法，檢測原理是檢測患者體液樣品中SARS-Co V-2特異性RNA序列。目前上市的核酸檢測試劑均采用新型冠狀病毒基因組中ORF1ab、E蛋白和N蛋白進(jìn)行選擇。不同產(chǎn)品的檢測原理基本一致，主要區(qū)別在于其設(shè)計(jì)的引物和探針，二重檢測的靶基因主要是雙靶區(qū)段（ORF1ab、N基因）、三重檢測的靶基因主要是三靶區(qū)段（ORF1ab、N基因和E基因）。核酸檢測方法包括基因測序法、實(shí)時(shí)熒光定量PCR法、微滴式數(shù)字PCR法和恒溫?cái)U(kuò)增芯片法等技術(shù)。最常用的是實(shí)時(shí)熒光PCR法，具有高特異性、高靈敏度的特點(diǎn)，是一種快速、成本較低且已在臨床廣泛使用的感染性病原體核酸檢測技術(shù)。對實(shí)驗(yàn)室人員的操作能力、儀器設(shè)備要求較高。

血清學(xué)方法檢測原理基于免疫學(xué)抗體檢測，是檢測新型冠狀病毒進(jìn)入人體后所產(chǎn)生的特異性抗體。方法包括：免疫層析法、酶聯(lián)免疫吸法及化學(xué)發(fā)光免疫分析法等。已上市的抗體檢測試劑主要針對檢測抗體Ig M、抗體Ig G及總抗體。抗體Ig M是機(jī)體受到病原體的攻擊后人體初次體液免疫應(yīng)答出現(xiàn)的抗體，是最先產(chǎn)生并迅速到達(dá)峰值的抗體，可用于早期診斷。抗體Ig G產(chǎn)生較晚，但在血清中濃度較高、親和力水平高，存在時(shí)間久，即使患者恢復(fù)后其濃度仍可保持較高水平，可被用于提示感染處于中后期或既往感染。與核酸檢測相比，病毒抗體檢測對臨床實(shí)驗(yàn)室的操作要求相對要低，而且抗體血清學(xué)檢測的樣本來源于外周血、血清或血漿，具有良好的穩(wěn)定性，從而可以提高檢測的敏感度。且血液樣本更易獲得，采集操作簡單快速，降低了醫(yī)護(hù)人員在樣本采集和檢測過程中被感染的概率?？贵w檢測具有速度快、通量高的特點(diǎn)，更易于在基層實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。但在人群流行率總體很低的情況下，病毒抗體檢測不適用于大面積復(fù)工、復(fù)產(chǎn)、復(fù)學(xué)等普通人群的篩查工作，也不適用于在低流行地區(qū)進(jìn)行流行病學(xué)的調(diào)查。

核酸檢測病毒的RNA，是病毒存在的直接證據(jù)，而機(jī)體感染病毒后產(chǎn)生體液免疫應(yīng)答，產(chǎn)生的抗體就是病毒存在間接證據(jù)，可以判斷患者是否近期或既往感染過2019新型冠狀病毒。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)（衛(wèi)健委）組織專家制定前六版《新型冠狀病毒肺炎診療方案》中都以病原學(xué)方法，如實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測和病毒基因測序作為診斷標(biāo)準(zhǔn)。而在2020年3月3日衛(wèi)健委發(fā)布《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》（以下簡稱《診療方案第七版》）中明確指出診斷標(biāo)準(zhǔn)在原有病原學(xué)方法基礎(chǔ)上，又增加“血清學(xué)檢查”作為診斷新型冠狀病毒肺炎判定的依據(jù)，即“血清新型冠狀病毒特異性Ig M抗體和Ig G抗體陽性”或“血清新型冠狀病毒特異性Ig G抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復(fù)期較急性期4倍以及以上升高”也可確診?！对\療方案第七版》中也增加疑似病例排除標(biāo)準(zhǔn)，即疑似病例排除必須滿連續(xù)兩次新型冠狀病毒核酸檢測陰性（采樣時(shí)間至少間隔24 h），且發(fā)病7 d后的新型冠狀病毒特異性抗體Ig M和Ig G仍然陰性。病毒核酸檢測仍然是新型冠狀病毒肺炎確診感染的“金標(biāo)準(zhǔn)”，而抗體檢測可以作為病毒核酸檢測的有效補(bǔ)充。

2 2019新型冠狀病毒檢測試劑盒上市情況

截至2020年7月16日，已有44個(gè)新型冠狀病毒檢測試劑盒經(jīng)國家藥監(jiān)局審批上市，均為定性檢測試劑?；诓≡瓕W(xué)檢查的新型冠狀病毒（2019-n Co V）核酸檢測試劑盒共計(jì)23個(gè)，其中16個(gè)熒光PCR法試劑、1個(gè)聯(lián)合探針錨定聚合測序法試劑、1個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法試劑、1個(gè)雜交捕獲免疫熒光法試劑、1個(gè)恒溫?cái)U(kuò)增-實(shí)時(shí)熒光法試劑、1個(gè)RNA捕獲探針法試劑、1個(gè)RNA恒溫?cái)U(kuò)增-金探針層析法試劑及1個(gè)雙擴(kuò)增法試劑。新型冠狀病毒（2019-n Co V）抗體檢測試劑盒共計(jì)21個(gè)，其中包括8個(gè)免疫層析試劑、11個(gè)化學(xué)發(fā)光法試劑、1個(gè)量子點(diǎn)熒光免疫法試劑、1個(gè)酶聯(lián)免疫法試劑。

3 2019新型冠狀病毒檢測試劑盒產(chǎn)品性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

2 0 2 0年2月8日，科技部發(fā)布《科技部關(guān)于發(fā)布新型冠狀病毒(2019-n Co V)現(xiàn)場快速檢測產(chǎn)品研發(fā)應(yīng)急項(xiàng)目申報(bào)指南》（后簡稱《申報(bào)指南》），面向社會(huì)征集更加快速、便捷、準(zhǔn)確的新型冠狀病毒的現(xiàn)場快速檢測產(chǎn)品。企業(yè)紛紛響應(yīng)國家政策號(hào)召，積極參與到SARS-Co V-2檢測試劑的研發(fā)生產(chǎn)活動(dòng)中來。但由于SARS-Co V-2是新發(fā)病毒，故在研發(fā)生產(chǎn)過程中存在諸多難題，如：時(shí)間緊迫、相關(guān)技術(shù)把控要點(diǎn)掌握不到位以及較難獲得足夠量的臨床樣本等。2020年2月12日，醫(yī)療器械技術(shù)審評中心發(fā)布了《2019新型冠狀病毒核酸檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)（試行）》（簡稱《核酸審評要點(diǎn)》），并在13 d后發(fā)布了《2019新型冠狀病毒抗原/抗體檢測試劑注冊技術(shù)審評要點(diǎn)（試行）》（簡稱《抗體審評要點(diǎn)》）。依據(jù)《審評要點(diǎn)》及其他已發(fā)布的相同方法學(xué)相關(guān)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合檢驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)的問題，建議企業(yè)對研發(fā)過程中可能影響產(chǎn)品性能和質(zhì)量的要點(diǎn)應(yīng)予重點(diǎn)關(guān)注，如：陽性判斷值確定、最低檢測限確定與驗(yàn)證、交叉反應(yīng)、精密度檢測方法、企業(yè)參考品的設(shè)置與制備、不同樣本類型的核酸提取方法/試劑驗(yàn)證、內(nèi)源/外源物質(zhì)干擾驗(yàn)證及血液樣本滅活方式等。

3.1 核酸檢測試劑性能質(zhì)量控制要點(diǎn)

3.1.1 陽性判斷值確定資料

由于目前該類試劑盒沒有計(jì)量學(xué)溯源性，所以確定資料主要是指對申報(bào)產(chǎn)品病毒核酸檢測的Ct值（結(jié)果判斷的臨界值）進(jìn)行確認(rèn)的資料。資料中樣本來源應(yīng)考慮盡可能多的因素，并選取具有代表性的樣本。對所選擇陽性判斷值研究方法的合理性，灰區(qū)建立的基礎(chǔ)、閾值設(shè)置的科學(xué)合理性進(jìn)行闡述和驗(yàn)證。

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