橙皮苷是黃酮類化合物,主要來源于賁香科柑橘屬植物。具有調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)、抗菌消炎、抗氧化、美白及機(jī)衰老等多種功能。橙皮苷是由兩個(gè)單糖和一個(gè)更細(xì)個(gè)選按敗其中的糖苷鍵，降低了橙皮育的浴解性。使共難溶于水,散溶于甲醇,且?guī)缀醪蝗苡诒?、丙桐和氯仿等有機(jī)溶劑,難以被人體吸收利用。橙皮苷脫掉一個(gè)鼠李糖后得到的產(chǎn)物為橙皮素單葡萄糖苷,它具有與橙皮苷相以的化學(xué)結(jié)構(gòu)功能,但與橙皮苷相比,橙皮素單匍萄糖具有更的溶解性,生物利用率更高。目前由橙皮苷制備橙皮素單葡萄糖苷主要有化學(xué)水解和生物酶解兩種方法?；瘜W(xué)法水解橙皮得到橙皮素單萄糖苷難以控制反應(yīng)條件,產(chǎn)率低且易造成環(huán)境污染,無法進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)。生物酶解法是利用α-L-鼠李糖苷酶(EC3.2.1.40)水解橙皮苷上的鼠李糖糖苷,得到橙皮素單葡萄糖苷，相比于化學(xué)法,生物法反應(yīng)條件溫和，且無污染，具有良好的應(yīng)用前景。α-L-鼠李糖苷酶在食品工業(yè)中,可用于柑橘類果汁脫苦,增強(qiáng)葡萄酒和飲料的香氣，在醫(yī)藥工業(yè)中，可用于改善藥物特性。

動物、植物組織和微生物都可以產(chǎn)生α-L-鼠李糖苷酶，其中，微生物產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶生產(chǎn)成本較低，且不受季節(jié)限制，應(yīng)用廣泛。海洋環(huán)境獨(dú)特多樣，蘊(yùn)含多種可分泌不同催化特性酶類的微生物，成為新穎酶類開發(fā)的主要源泉。本研究從海洋樣品中篩選產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶的細(xì)菌，并對菌株的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究，為新穎α-L一鼠李糖苷酶的開發(fā)及應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1樣品來源

連云港市連云區(qū)海州灣高公島海域海泥樣品，置于冰盒，盡快帶回進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2主要設(shè)備及藥品

SW-CJ-1D單人超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；CR22G高速離心機(jī)：株式會社日立制作所；IMark酶標(biāo)儀：伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；LS50SⅡ立式高壓蒸汽滅菌鍋：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；90i全電動顯微鏡：株式會社尼康等。
柚皮苷、₂KHPO₄·3H₂O、MgSO₄·7H₂О等生化試劑均為分析純：國藥集團(tuán)試劑公司；裂解緩沖液：TaKaRa；引物合成：南京思普金生物公司。

1.3培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：1.0g橙皮苷，0.2gNaNO₃,0.1gK₂HPO₄·3H₂O，0.05gKCl，0.05gMgSO₄·7H₂0，0.02gFeSO₄·H₂O，溶于100mL陳海水。

發(fā)酵培養(yǎng)基：0.75g蔗糖，0.25g橙皮苷，0.25gNaNO₃，0.05gK₂HPO₄·3H₂O，0.025gKC1，0.025gMgSO₄·7H₂0，0.001gFesO₄·7H₂O，溶于50mL陳海水。

1.4實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶海洋細(xì)菌的篩選

準(zhǔn)確稱取2.5g高公島海域泥土樣品，加入到100mL滅菌的富集培養(yǎng)基，30℃，200r/min振蕩培養(yǎng)48h。取6支試管，各加入9mL陳海水，高壓滅菌后冷卻。移液槍吸取1mL富集培養(yǎng)基加入1號試管，充分振蕩混勻后從1號試管吸取1mL溶液加入2號試管，依次10倍濃度梯度稀釋。分別吸取50uL稀釋液，均勻涂布于篩選培養(yǎng)基平板，30℃倒置培養(yǎng)7d，觀察是否出現(xiàn)透明圈。挑取產(chǎn)生透明圈的菌落在LB培養(yǎng)基上分離純化。從純化后的培養(yǎng)基上挑取單菌落點(diǎn)樣至篩選培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)，若單菌落周圍出現(xiàn)透明圈，則認(rèn)為該菌能產(chǎn)α-L-鼠李糖苷酶。

1.4.2菌株DTCO3的鑒定

根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》對菌株DTCO3進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和生理生化鑒定。

1.4.3菌株DTCO3的16SrDNA擴(kuò)增及分析

用滅菌的牙簽蘸取菌株DTC03，加入至20uL裂解液。80℃水浴鍋靜置15min后即為PCR模板。所采用的引物分別為27F:5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'PCR。體系為：3.5μLddH2O，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL模板，5μLpremix。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至南京思普金公司測序，所得序列提交GenBank。將該序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源性比對，用MEGA7.0軟件進(jìn)行16SrDNA序列的比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4.4α-L-鼠李糖苷酶酶活力的測定

離心管中分別加入170μLpH6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和20μL10mmol/L的對硝基苯基-μ鼠李糖苷(pNPR)，45℃預(yù)熱15min后加入10μL酶液，反應(yīng)20min后，立即加入50μL2mol/LNa₂CO₃終止反應(yīng)。反應(yīng)體系中的酶液沸水浴滅活15min作為對照。8000r/min離心10min，測定上清液的A₄₀₅。

Α-L-鼠李糖苷酶酶活力單位(U)的定義：在最適反應(yīng)條件下，每分鐘內(nèi)催化1μg底物(pNPR)轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需要的酶量，即為一個(gè)酶活力單位。

1.4.5菌株DTCO3α-L-鼠李糖苷酶酶學(xué)性質(zhì)研究

α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性：試管中各加入170μLpH6.5的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液和20μL10mmol/LpNPR，分別在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃下預(yù)熱15min后加入10μL酶液,反應(yīng)20mim后，測定酶活,最高酶活性設(shè)為100%。酶液分別20℃、30℃、40℃、50℃、60℃和70℃條件下保溫1h后測定其酶活力，最高酶活性設(shè)為100%，探究溫度對其穩(wěn)定性的影響。

α-L-鼠李糖苷酶的最適pH及穩(wěn)定性：配制pH4.0～9.0的緩沖液，測定酶液在不同pH條件下的酶活力。室溫下，用pH4.0～9.0的緩沖溶液分別孵育酶液12h后，測定其剩余酶活力，并以未用緩沖液處理過的酶為對照，對照組酶活定義為100%。所用的緩沖液體系為醋酸–醋酸鈉(pH4.0～6.0)、磷酸–磷酸鈉緩沖液(pH6.0～8.0)、Tris-HCl緩沖液(pH8.0～10.0)。

金屬離子對α-L-鼠李糖苷酶活性的影響：在最適反應(yīng)條件下，在反應(yīng)體系中添加終濃度為2mM的金屬離子溶液(金屬離子包括Cu²⁺、Zn²⁺、Cd²⁺、Mg²⁺、Mn²+、Ni²⁺、Ba²⁺、Al³⁺和Co²⁺)。以不添加金屬離子的酶活為100%。

1.5數(shù)據(jù)處理與分析

每組試驗(yàn)設(shè)3組平行，重復(fù)試驗(yàn)3次，試驗(yàn)結(jié)果用平均值土標(biāo)準(zhǔn)方差(n=3)表示，采用Origin9.0作圖。
 

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