3.3 真菌毒素檢測

真菌毒素如黃曲霉毒素B1(AFB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)等極易污染糧食、谷物、咖啡、啤酒和茶葉等,對動物和人具有致畸、致癌、致突變和免疫抑制等毒性作用。當(dāng)前,對AFB1、OTA、ZEN等的檢測以傳統(tǒng)的儀器分析法為主,如高效液相色譜法、薄層色譜等。這類方法靈敏度高且準(zhǔn)確性好,但存在樣品前處理復(fù)雜、需要專業(yè)操作人員和設(shè)備昂貴等不足,限制了其在基層的推廣使用。因此,開發(fā)低成本快速檢測抗生素的方法作為大型精密儀器分析法的有力補(bǔ)充顯得尤為重要。

Qiu等分別制備了疊氮基-OTA適配體修飾的磁珠(N3-OTA適配體-MBs,DNA1)和蔗糖轉(zhuǎn)化酶功能化的炔基-DNA偶聯(lián)物(炔基DNA-蔗糖轉(zhuǎn)化酶,DNA2),以個人血糖儀(Personal glucose meter,PGM)作為信號讀出器建立了微量OTA(72 pg/mL)的檢測方法。DNA1與DNA2間發(fā)生CuAAC反應(yīng)形成雙鏈的dsDNA,存在OTA時,OTA與其適配體結(jié)合,使得dsDNA雙鏈解開,經(jīng)磁珠分離后上清液中的DNA2量增多,PGM信號變強(qiáng),從而實(shí)現(xiàn)對OTA的高靈敏檢測。

Xu等通過光引發(fā)多面體低聚倍半硅氧烷(Polyhedral oligomeric silsesquioxane,POSS) 單體聚合形成含活性烯基的剛性骨架,并在70 ℃下引發(fā)巰基化的玉米烯酮適體(SH-ZEN適體)和烯基間的“巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)”,得到被極性適體致密包被的親和整體柱,最終與HPLC聯(lián)用對大米中的ZEN進(jìn)行檢測,實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。Chen等基于自由基聚合和“硫醇-烯”點(diǎn)擊反應(yīng),采用“一鍋法”直接制備了一種新型的基于OTA適體的含POSS雜合親和性整體柱,并用于啤酒樣品中OTA的檢測,該法特異性好且能夠檢測痕量OTA。

3.4 重金屬檢測

微量金屬如銅、鐵等是人體生長發(fā)育的必需元素,但攝入過量或者不足以及不平衡均會引起人體生理異常或發(fā)生疾病。此外,環(huán)境中的重金屬如汞、鎘等也會影響人體健康。因此,開發(fā)金屬殘留的高靈敏檢測方法極為重要。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)技術(shù)具有靈敏度高、反應(yīng)速度快等優(yōu)勢,常作為反應(yīng)信號放大手段用于分析檢測。氧化石墨烯(GO)是一種理想的能量受體,可與許多物質(zhì)發(fā)生FRET猝滅其熒光。Zheng等利用炔基修飾的氧化石墨烯(GO-C2)和疊氮基修飾的羅丹明100(Rho-N3)間發(fā)生CuAAC反應(yīng)導(dǎo)致Rho-N3的熒光被顯著猝滅的機(jī)理,實(shí)現(xiàn)了Cu2+的高靈敏檢測。該方法可以高效快速(1 min)地檢測尿液中的Cu2+,為臨床診斷提供了一定的理論基礎(chǔ)(圖2A)。

在AuNPs的局部表面等離子體激元共振(LSPR)和CuAAC反應(yīng)高特異性的基礎(chǔ)上,Zhou等通過配體交換反應(yīng)制備了疊氮基和炔基修飾的AuNPs,利用CuAAC反應(yīng)使兩種AuNPs交聯(lián)并引發(fā)聚集使體系溶液從紅色變?yōu)樗{(lán)色,進(jìn)而通過肉眼對Cu2+進(jìn)行了定性檢測。Carol等通過二炔交聯(lián)劑誘導(dǎo)疊氮基修飾的AuNPs聚集實(shí)現(xiàn)了Cu2+的靈敏檢測,檢測限低至1.8 μmol/L。AuNPs易在高濃度鹽溶液中發(fā)生聚集,導(dǎo)致顏色由紅變藍(lán),但是谷胱甘肽存在時則會抑制這一現(xiàn)象。

除CuAAC反應(yīng)外,光或熱引發(fā)的“巰-烯”點(diǎn)擊化學(xué)也常應(yīng)用于材料修飾中。Zuo等通過光引發(fā)的“巰-烯點(diǎn)擊化學(xué)”合成咪唑官能化聚硅氧烷(PMMS-IM),該材料在365 nm處表現(xiàn)出強(qiáng)烈熒光。過渡金屬離子Fe3+等能夠與富電子基團(tuán)發(fā)生配位結(jié)合而引起熒光猝滅,故作者將PMMS-IM用作Fe3+的熒光檢測探針,并用于檢測Hela細(xì)胞中Fe3+的原位循環(huán)。

脫氧核酶(DNAzyme)是在體外篩選、擴(kuò)增獲得的一種具有催化功能的DNA片段,可形成G-四鏈體并結(jié)合血紅素,適用于小分子、金屬離子、DNA等的檢測。Li等結(jié)合Cu+催化的點(diǎn)擊化學(xué)和Mg2+依賴性DNAzyme循環(huán)擴(kuò)增的策略,開發(fā)了一種可靈敏檢測人血清中Cu2+的比色傳感法,該方法的線性范圍為5～500 nmol/L,檢測限低至2 nmol/L(圖2B)。

CuAAC反應(yīng)生成的三唑環(huán)在檢測體系中具有極大的作用:(1)作為與目標(biāo)分析物的結(jié)合位點(diǎn);(2)作為離子載體與熒光團(tuán)之間的連接基團(tuán)。Hou等利用CuAAC反應(yīng)合成了含有兩個三唑環(huán)的新型二甲苯苯基環(huán)烷烴1,其在292 nm激發(fā)波長處具有強(qiáng)熒光。在甲醇溶液中,該環(huán)烷烴1的三唑環(huán)能特異性地結(jié)合Ag+,同時,由于螯合增強(qiáng)熒光猝滅(CHEQ)效應(yīng),使得環(huán)烷烴1的熒光被顯著猝滅,從而可實(shí)現(xiàn)對Ag+的檢測。Zhang等利用Cu+觸發(fā)UiO-66-N3與苯乙炔的點(diǎn)擊反應(yīng),合成了一種新型金屬有機(jī)骨架(MOF)熒光探針UiO-66-PSM,該探針的三唑環(huán)可以與Hg2+配位結(jié)合猝滅UiO-66-PSM的熒光,較其他金屬離子表現(xiàn)出更明顯的熒光響應(yīng),且在水溶液中有很好的穩(wěn)定性,可用于環(huán)境水體中Hg2+的檢測。

Fomo等基于疊氮基苯胺鹽酸鹽與炔烴封端的金屬鈦氰(MPc)的CuAAC反應(yīng),制備了一種新型低對稱炔末端鈷——酞菁鈷(CoPc)。將該CoPc經(jīng)差動脈沖溶出伏安法(DPSV)修飾于玻碳電極上,可同時檢測Hg2+、Cu+、Pb2+、Cd2+和As3+等金屬離子。

3.5 食源性致病菌

食源性疾病是全球最突出的公共衛(wèi)生問題之一,隨著食品供應(yīng)鏈的快速發(fā)展,食源性疾病在全球各地的蔓延不僅危害人體健康,還會造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)問題。目前食源性致病菌的檢測手段主要是傳統(tǒng)的選擇性平板培養(yǎng)和凝集實(shí)驗(yàn)等,以上方法存在操作繁瑣、檢測周期長等缺點(diǎn),不能滿足食源性致病菌快速檢測的迫切需求。

Huang等開發(fā)了一種無酶生物傳感器用于快速(1 h內(nèi))檢測沙門氏菌。研究者首先制備了姜黃素-牛血清白蛋白納米顆粒(CUR-BSA),通過反式環(huán)辛烯(Tz)-1,2,4,5-四嗪(TCO)間的無銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)形成Tz-TCO-CUR復(fù)合物后將其進(jìn)行抗體功能化,并結(jié)合磁分離技術(shù)對沙門氏菌進(jìn)行定性和定量檢測,方法檢測限低至50 CFU/mL。

此外,Guo等綜合旋轉(zhuǎn)磁分離法、金納米管(GNR)指示法以及Tz-TCO點(diǎn)擊化學(xué)信號放大法,建立了一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的比色免疫傳感器。該免疫傳感器檢測時間為3 h,線性范圍為101～105 CFU/mL,檢出限為35 CFU/mL。

大腸桿菌(E.coli)能夠特異性地捕獲環(huán)境中的Cu2+將其還原為Cu+,Mou等基于此并利用疊氮-AuNPs和炔烴-AuNPs的CuAAC反應(yīng),實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌的快速靈敏檢測。當(dāng)存在E.coli時,外源性Cu2+被E.coli還原為Cu+而觸發(fā)CuAAC反應(yīng),導(dǎo)致金納米顆粒聚集并使體系由紅色變?yōu)樗{(lán)色,僅用肉眼即可快速輕松地實(shí)現(xiàn)病原菌的檢測。

4 結(jié)論與展望

作為一類新型的合成反應(yīng),點(diǎn)擊化學(xué)由于其生物相容性和環(huán)境友好性等優(yōu)勢被大量研究,并在諸多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。值得注意的是,將免疫分析法和點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)有效結(jié)合,能夠?qū)崿F(xiàn)分析物更加快速靈敏的檢測,例如,利用基因工程技術(shù)制備抗體與反應(yīng)底物催化酶的融合蛋白用于替代傳統(tǒng)免疫分析法中的一抗和酶標(biāo)二抗,能夠減少孵育反應(yīng)次數(shù)和洗滌次數(shù),極大地縮短檢測時間,同時避免了過多孵育和洗滌次數(shù)對靈敏度的影響。當(dāng)前,點(diǎn)擊化學(xué)在食品安全檢測領(lǐng)域的應(yīng)用研究尚處于初期階段,盡管已取得了較好的研究進(jìn)展,但現(xiàn)階段點(diǎn)擊化學(xué)自身存在的局限性仍需引起研究人員的重視。如:(1)點(diǎn)擊化學(xué)的發(fā)生需要特定的反應(yīng)基團(tuán)參與,而在納米材料上修飾反應(yīng)基團(tuán)則操作繁瑣費(fèi)時;(2)點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)類型較少,已報道的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)大部分都是疊氮化物與端基炔的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)和巰基-烯加成反應(yīng);(3)需要加入過量的銅鹽使點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)完全,提高了反應(yīng)成本;(4)疊氮化合物危險性高、毒性強(qiáng),嚴(yán)重威脅研究人員的生命健康。因此,針對上述問題,亟需開發(fā)出更為經(jīng)濟(jì)、綠色、安全的點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)類型,使點(diǎn)擊化學(xué)在食品安全檢測領(lǐng)域得到更為深入的研究,同時有助于拓寬點(diǎn)擊化學(xué)在其他研究方向的應(yīng)用。

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