5、堿性磷酸酶和辣根過氧化酶系統(tǒng)

除了直接的熒光標簽如熒光素堿性蕊香紅、香豆素(Coumarin)或它們各自的衍生物外，最常使用的非放射性指示劑系統(tǒng)是用堿性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，AP)作為標志酶。在簡單的一步反應(yīng)中，它與寡脫氧核苷酸直接結(jié)合，寡脫氧核苷酸的5’位置與AP的偶合是以雙功能鍵作為媒介。用辣根過氧化酶(Horseradish Peroxidase，HRP)直接標記寡核苷酸效率低，因此：HRP主要用于標記多核苷酸片段。直接標記的AP探針，能達到與放射性標記或間接非放射性標記寡核苷酸同樣高的特異性，這是因為AP雖然必須與每單個寡核苷酸探針結(jié)合，但是它省略掉間接系統(tǒng)中特定的探針修飾基團與相結(jié)合成分之間的結(jié)合反應(yīng)，就是用AP修飾具有確定序列的寡核苷酸的例子。被檢測的樣品經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和膜印跡后，所形成的序列梯狀帶能直接地被用AP催化的光學(xué)反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)觀察到。

二、探針標記方法

(一)探針的放射性核素標記法

這里主要以放射性核素豫P為例，介紹核酸探針與標記的連接方法(標記方法)。其他核素的標記方法與之相似，可參照此進行。

1、缺口平移法

缺口平移法(Nick translation)的原理是：將DNA酶I(DNase I)的水解活力與大腸桿菌DNA聚合酶I(DNA pol I)5’→3’的聚合酶活力和5’→3’的外切酶活力結(jié)合。首先用適當濃度的DNase I在探針DNA雙鏈上造成缺口，然后再借助于E．coli的DNA pol I 5’→3’的外切酶活力，切去帶有5’-磷酸的核苷酸；同時又利用該酶的5’→3’聚合酶活力，使生物素或同位素標記的互補核苷酸補入缺口。DNA聚合酶I的這兩種活力交替作用，使缺口不斷向3’的方向移動，同時DNA鏈上的核苷酸不斷為標記的核苷酸所取代，成為帶有標記的DNA探針，經(jīng)純化除去游離的脫氧核苷酸，即成純化的標記DNA探針。缺口平移標記法可對環(huán)狀或線狀雙鏈DNA進行標記。

需要注意的是，DNase I活性控制到什么程度是缺口平移標記法成敗的關(guān)鍵，另外，缺口平移標記法產(chǎn)生的探針是雙鏈DNA，用時要預(yù)先變陛后再使用。

2、隨機引物法

隨機引物(Random priming)是含有各種可能排列順序的寡聚核苷酸片段混合物，因此它可以與任意核酸序列雜交，起到聚合酶反應(yīng)的引物作用。目前市售的試劑盒中，隨機引物是用人工合成方法得到的，寡核苷酸片段長度為6個核苷酸殘基，含有各種可能的排列順序(4⁶=4096種排列順序)。

將待標記的DNA探針片段變性后與隨機引物(一些六聚核苷酸)一起雜交，然后以此雜交的寡核苷酸為引物，在大腸桿菌DNA聚合酶I大片段(E．coli DNA polymer-rase I Klenow Fragment)的催化下，按堿基互補配對的原則，不斷在其3’-OH端添加同位素標記的單核苷酸(α一³²P—dNTp)修補缺口，即形成放射性核素標記的DNA探針。

除能進行雙鏈DNA標記外，隨機引物法也可用于單鏈DNA和RNA探針的標記。當采用單鏈DNA片段或RNA作為模板時，必須注意所得到的標記探針并不是其本身，而是與其互補的單鏈DNA片段。如果需要其本身作為探針，則必須采用其互補鏈或雙鏈DNA作為模板。當以RNA為模板時，操作方法同上，但必須采用反轉(zhuǎn)錄酶，得到的產(chǎn)物是標記的單鏈cDNA探針。此法得到的探針放射活性極高，而高放射性會造成DNA鏈的破壞，因此標記的DNA探針應(yīng)立即使用。

3、單鏈DNA探針的標記

單鏈DNA探針與雙鏈DNA探針相比，其雜交效率更高。這是由于雙鏈：DNA探針在雜交時，除與目的基固序列雜交外，雙鏈DNA探針兩條鏈之問還會形成自身的無效雜交；而單鏈DNA探針避免了這種缺點，主要適用于克隆于M13噬菌體中的DNA片段的標記。選用適當?shù)囊镆部捎糜谫|(zhì)粒DNA中插入順序的標記。

一般采用M13噬菌體體系進行單鏈DNA探針的標記。人工合成的寡核苷酸作為引物，首先與克隆了特異基因片段的M13噬菌體DNA雜交，在α-³²P-dNTP的存在下，利用E．coli DNA polymerase I Klenow片段的鏈延伸反應(yīng)，合成高放射性的單鏈DNA探針。用適當?shù)南拗菩詢?nèi)切酶切取所需探針序列，然后用變性膠電泳分離得到單鏈DNA探針。雙鏈RP型M13DNA也可方便地用于單鏈。DNA探針的制備，選擇適當?shù)囊锟傻玫较鄳?yīng)的正鏈或負鏈DNA單鏈探針。作為引物的寡核苷酸，一般采用互補于M13噬菌體多克隆位點3’端序列的“通用引物”(正鏈引物：5’-CACAATTCCACACAAC-3’，負鏈引物：5’-TCCCAGTCACGACGT-3’)；也可以人工合成一段互補于插入序列的寡核苷酸片段作為引物。

4、cDNA探針的標記

來源于鳥類髓母細胞病毒(AMV)的反轉(zhuǎn)錄酶，是一種依賴于RNA的DNA聚合酶，具有多種酶促活性，包括5’→3’DNA聚合酶活性及RNA／DNA雜交體特異的RNase H酶活性。此酶主要應(yīng)用于將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA而應(yīng)用于cDNA克隆，亦可用于RNA或單鏈。DNA模板的強P標記探針的制備。當以poly(A)mRNA為模板時，反轉(zhuǎn)錄酶的引物可以是oligo-dT，也可采用特異的寡核苷酸引物，還可采用隨機寡核苷酸作為引物。反轉(zhuǎn)錄得到的產(chǎn)物：RNA／DNA雜交雙鏈經(jīng)堿變性后，RNA單鏈可被迅速降解成小片段，經(jīng)Sephadex G-50柱層析即可得到單鏈DNA探針。

5、寡核苷酸探針的標記

人工合成的寡核苷酸片段作為分子雜交的探針，已日益為更多的研究者所青睞。利用寡核苷酸探針，可以檢測到靶基因上單個核苷酸的點突變。多種酶促反應(yīng)可用于寡核苷酸探針的末端標記，如T4多核苷酸激酶、Klenow DNA聚合酶、末端脫氧核苷酰轉(zhuǎn)移酶等。

參考資料：現(xiàn)代食品檢測技術(shù)，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請與本網(wǎng)聯(lián)系

相關(guān)鏈接：香豆素，DNA聚合酶，核苷酸，病毒