4、R.oryraeMG1發(fā)酵姜油樹脂條件的響應(yīng)面分析

（1）響應(yīng)面模型建立及方差分析

依據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇姜油樹脂添加量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間用BBD程序設(shè)計三因素三水的平響應(yīng)面優(yōu)化方案，共17次試驗，結(jié)果見表1。多元回歸擬合得到的二階多項回歸方程模型為：

Y=-4917.80206+50.60680X₁+248.91550X₂+462.95900X₃+0.077975X₁X₂+0.38

830X₁X₃-3.54325X₂X₃-0.37321X₁²-3.60654X₂²-44.66781X₃²，可表示經(jīng)R.oryzaeMGI發(fā)酵后姜油樹脂總抗氧化活性(Y)與姜油添加量(X₁)、發(fā)酵溫度(X₂)、發(fā)酵時間(X₃)的聯(lián)系。

方差分析見表2，回歸效應(yīng)顯著(p＜0.05)，說明方程模型置信度高于95%；失擬項不顯著(p＞0.05)，說明方程模型自然誤差不顯著，擬合度好；復(fù)相關(guān)系數(shù)R²=0.9917，說明方程模型與實驗數(shù)據(jù)的符合度可達99.17%；調(diào)整性決定系數(shù)AdjR²=0.9811，說明方程模型可信度高?；谏鲜龇治?，回歸方程模型可以用來預(yù)測因素(X₁、X₂和X₃)與響應(yīng)值(Y)的關(guān)系。

每個因素以及各因素互交作用對試驗結(jié)果的線性效應(yīng)的影響是否顯著以p值表示，p值越小影響越顯著(p＜0.05)。由表2可見，X₁、X₂對發(fā)酵后姜油樹脂的TAC影響顯著，X₃對發(fā)酵后姜油樹脂的TAC影響不顯著；X₁²、X₂²、X₃²對發(fā)酵后姜油樹脂的TAC影響極顯著；X₁X₂、X₁X₃、X₂X₃互交對發(fā)酵后姜油樹脂的TAC影響均不顯著。由此可知，試驗各因素對MG1發(fā)酵后姜油樹脂的總抗氧化活性影響的顯著程度為:姜油樹脂添加量＞發(fā)酵溫度＞發(fā)酵時間。

由圖8可見，姜油樹脂添加量與發(fā)酵時間、發(fā)酵溫度與時間之間交互作用顯著，姜油樹脂添加量與發(fā)酵溫度之間交互作用不顯著，與響應(yīng)面方差分析(表2)結(jié)果吻合。響應(yīng)面3D模型見圖8，隨姜油樹脂添加量增加，發(fā)酵后姜油樹脂的TAC先增加后降低；隨溫度的升高，TAC同樣先增加后降低；隨發(fā)酵時間延長，TAC先緩慢增加，然后趨于平緩，與單因素試驗結(jié)果相吻合。等高線的形狀反映了各因素交互效應(yīng)的強弱，橢圓形的離心率越接近1表示兩因素交互作用越顯著。由圖8可見，姜油樹脂添加量與發(fā)酵時間、姜油樹脂添加量與發(fā)酵溫度、發(fā)酵溫度與時間之間交互作用均不顯著，與響應(yīng)面方差分析(表2)結(jié)果吻合。

經(jīng)軟件分析計，R.oryzae算MG1發(fā)酵姜油樹脂的最佳模擬條件為:在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加姜油樹脂73.47μL，33.25C震蕩(150r/min)培養(yǎng)4.18d，在此條件下總抗氧化活性預(yù)測值可達2046.94umol/g。

（2）模型的驗證

為了驗證R.oryzaeMG1發(fā)酵姜油樹脂抗氧化性能條件的可靠性，在模擬預(yù)測條件的基礎(chǔ)上，根據(jù)實際情況，為方便控制實驗操作條件以減少誤差，最終確定的R.oryzaeMG1發(fā)酵姜油樹脂條件為70μL的姜油樹脂添加量，33℃下震蕩(150r/min)培養(yǎng)4d。三次重復(fù)實驗的總抗氧化活性平均為2025.44土5.01μmolg，實驗值與理論預(yù)測值無顯著性差異，擬合性較好，表明此模型是有效的，可用于預(yù)測MGI發(fā)酵姜油樹脂的實際實驗情況，具有一定的實踐參考價值。在此條件下MG1發(fā)酵姜油樹脂培養(yǎng)物的總抗氧化活性比對照組提高了69.15士1.01%，比優(yōu)化前提高了7.17+0.91%，如圖9所示。

5、姜油樹脂活性成分高效液相色譜分析

發(fā)酵完成后，將培養(yǎng)基真空干燥后用甲醇超聲萃取，取適量用0.22μm的尼龍膜過濾進樣，進樣體積10μL，檢測波長280nm，流動相為乙腈和1%的冰醋酸，流速1.0mL/min，柱溫48℃，運行時間62min，進行梯度洗脫。

積分結(jié)果如圖10所示，姜油樹脂中約有14種物質(zhì)，經(jīng)R.oryzaeMG1發(fā)酵后，以1號物質(zhì)(6-姜酚)為參照，假設(shè)在其峰面積相等的情況下，2號物質(zhì)(8-姜酚)的峰面積比發(fā)酵前減少了0.17倍，3號物質(zhì)(6-姜烯酚)的峰面積比發(fā)酵前減少了0.37倍，4號物質(zhì)(10-姜酚)的峰面積比發(fā)酵前減少了0.22倍，15號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前減少了0.69倍；11、12、14號物質(zhì)缺失；6號物質(zhì)(10-姜烯酚)峰面積幾乎不變；7號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前提高了4.60倍，8號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前提高了1.03倍，9號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前提高了3.34倍、10號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前提高了5.56倍，13號物質(zhì)峰面積比發(fā)酵前提高了3.10倍；出現(xiàn)了5號(8-姜烯酚)16、17、18號物質(zhì)。

說明經(jīng)過R.oryzaeMG1的發(fā)酵，姜油樹脂發(fā)酵提取物中的成分部分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，已知的五種物質(zhì)相對含量降低，不僅使其他物質(zhì)含量升高，還生成了新物質(zhì)，總抗氧化活性較高隨之提高。后續(xù)實驗需進一步將新檢測出的物質(zhì)分離純化，進行結(jié)構(gòu)鑒定。

三、結(jié)論

本文通過對5株根霉發(fā)酵姜油樹脂的抗氧化活性進行比較，R.oryzaeMG1表現(xiàn)出較強的發(fā)酵能力，抗氧化活性最高，且發(fā)酵液氣味更清新，辛辣的氣味減弱，有淡淡的檸檬香味。再以單因素及響應(yīng)面方法優(yōu)化得到了R.oryzaeMGI的最佳發(fā)酵條件，即在20mLPDA液體培養(yǎng)基中接種1%的MG1孢子懸液，姜油樹脂添加量70uL，33℃下震蕩(150r/min)培養(yǎng)4d，發(fā)酵后姜油樹脂的抗氧化活性比發(fā)酵前提高了69.15士1.01%；經(jīng)高效液相色譜分析，姜油樹脂的R.oryzaeMG1發(fā)酵提取物中的成分發(fā)生了轉(zhuǎn)化，且生成了4種新物質(zhì)。由此可說明，R.oryzaeMG1的發(fā)酵對姜油樹脂的抗氧化活性的提升及風(fēng)味改善有一定的效果，可以據(jù)此研究開發(fā)高附加值的生姜風(fēng)味發(fā)酵食品。

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