作為一種常見的香辛料，生姜含有多種生物活性成分，包括不揮發(fā)且有刺激性氣味的姜辣素，具有抗氧化、抑菌、散寒、活血等作用。姜油樹脂是經(jīng)超臨界CO₂萃取干姜而得到的半液態(tài)混合物，充分保留了生姜的活性成分與獨特風(fēng)味，是天然的香料與防腐劑。但由于其特有的辛辣刺激性氣味，使產(chǎn)品不易被大眾接受，而且姜油樹脂中生物活性更高、不良?xì)馕遁^弱的姜烯酚類等含量很少，既影響了功效發(fā)揮，也限制了市場應(yīng)用。目前，對生姜活性的提升主要采用化學(xué)物理方法，效率低，成本高，副作用還多，而通過微生物發(fā)酵提高生姜生物活性方面的研究較少。

霉是傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)的優(yōu)良菌種，可利用不同的原料在特定的條件下發(fā)酵和代謝生產(chǎn)人們所需的各種產(chǎn)物，如L-乳酸、L-蘋果酸、富馬酸和脂肪酶等，以及其他特異性酶及特殊代謝產(chǎn)物，在食藥、環(huán)保等領(lǐng)域的應(yīng)用也不斷開拓。

本實驗以乳化姜油樹脂為底物進(jìn)行根霉發(fā)酵，通過測定根霉生物量、培養(yǎng)物pH、抗氧化活性、發(fā)酵液成分等指標(biāo)，分析根霉發(fā)酵對生姜活性物質(zhì)抗氧化活性的影響，為高附加值生姜風(fēng)味發(fā)酵食品的開發(fā)及天然生姜資源優(yōu)勢的利用提供理論基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1、材料與設(shè)備

根霉菌株:RhizopusoryzaeMG1、RhizopusoryzaeMG4、RhizopusoryzaeMG5（分離于清香大曲)，RhizopustonkinesisDMG(分離于東京根霉曲)，安琪根霉AMG(分離于安琪甜酒曲，安琪股份有限公司產(chǎn)品)，均保藏于山西師范大學(xué)生物工程實驗室。

姜油樹脂，青島利和萃取股份有限公司產(chǎn)品；PDA培養(yǎng)基、瓊脂粉，青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，DPPH、ABTS，TPTZ、水溶性維生素E，北京伊諾凱科技有限公司品，乙酸乙酯、甲醇、乙酸、乙酸鈉、濃鹽酸、過硫酸鉀、吐溫-80，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；FeCl₃·6H₃O，上海展云化工有限公司產(chǎn)品。以上試劑均為分析純6-、8-、10-姜酚(6-G、8-G、10-G)以及6-、8-、10-姜烯酚(6-s、8-S、10-S)標(biāo)準(zhǔn)品，美國Chromadex公司，色譜甲醇，色譜乙腈，賽默飛世爾科技公司；超純水，娃哈哈有限公司。

FA2204B型電子天平，上海精科產(chǎn)品；YXO-LS-50SI型高壓蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-2FD型超凈工作臺，上海博訊產(chǎn)品:HPX-9272MBE型數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，上海一恒產(chǎn)品:SHA-C型水浴恒溫振蕩器，上海福瑪實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品:pH-3C型pH計，上海雷磁產(chǎn)品；5804R型高速冷凍離心機(jī)，德國基因有限公司產(chǎn)品；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；752N型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司產(chǎn)品；1260LC高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司產(chǎn)品。

2、實驗方法

（1）菌種活化及孢子懸液制備

將保藏的根霉菌株接種于馬鈴薯葡萄糖(PDA)液體培養(yǎng)基，28℃震蕩(150r/min)活化三天后轉(zhuǎn)接于PDA斜面培養(yǎng)基上28℃培養(yǎng)4d，此時菌絲長滿黑色的孢子，用無菌生理鹽水洗滌斜面制備孢子懸液，稀釋調(diào)節(jié)孢子懸液濃度約5x10⁵/mL，28℃震蕩(150r/min)培養(yǎng)8h，促使孢子萌發(fā)，備用。

（2）姜油樹脂預(yù)處理

取10mL吐溫-80置于棕色瓶中，高壓蒸汽滅菌后加入10mL姜油樹脂，攪拌均勻，使姜油充分乳化，加入無菌水80mL，稀釋10倍，攪拌均勻備用。以上步驟均需無菌操作。此狀態(tài)下姜油樹脂乳濁液體系均勻，在室溫下靜置或冷藏狀態(tài)下均不會發(fā)生油水分層。后文添加量按乳濁液中姜油樹脂的實際體積計算。

（3）發(fā)酵液預(yù)處理

在20mLPDA液體培養(yǎng)基中接種1%的孢子懸液，添加適量姜油樹脂稀釋液為底物，28℃震蕩(150r/min)培養(yǎng)4d。將發(fā)酵液全部移入離心管，殘渣用5mL蒸餾水洗滌后移入離心管，離心管中加入15mL乙酸乙酯，混合均勻后6000r/min離心20min，用醫(yī)用注射器吸取乙酸乙酯上清液，氮吹干燥，甲醇定容至10mL，-20℃冰箱儲存。以根霉發(fā)酵后，再添加姜油樹脂為對照。

（4）根霉生物量的測定

姜油樹脂添加到PDA液體培養(yǎng)基中與根霉共發(fā)酵，每8h取樣測定培養(yǎng)物pH與菌絲濕重，繪制相應(yīng)的pH曲線與生長量曲線。

（5）根霉發(fā)酵姜油樹脂條件的單因素試驗

在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加適量姜油樹脂，接種1%的孢子懸液，選擇姜油樹脂添加量、發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間進(jìn)行單因素試驗。固定發(fā)酵溫度35℃和發(fā)酵時間4d，研究分別添加10μL、20μL、30μL、40μL、50μL、60μL、70μL、80μL、90μL、100μL、120μL、140μL、160μL、180uL、200μL姜油樹脂經(jīng)發(fā)酵后的總抗氧化活性。固定姜油樹脂添加量70μL與發(fā)酵時間4d，研究20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃下姜油樹脂經(jīng)發(fā)酵后的總抗氧化活性。固定姜油樹脂添加量70μuL與培養(yǎng)溫度35℃，研究經(jīng)1～7d發(fā)酵后姜油樹脂的總抗氧化活性。

（6）根霉發(fā)酵姜油樹脂條件的響應(yīng)面分析

以單因素試驗為基礎(chǔ)，選姜油樹脂添加量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間為自變量，發(fā)酵后姜油樹脂的總抗氧化活性為響應(yīng)值，使用DesignExpertversion8.06(MinneapolisMN，USA)軟件的BBD(Box-Behnkendesign)程序，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化方案設(shè)計，其中的方差分析(analysisofvariance，ANOVA)程序用于實驗數(shù)據(jù)分析和模型擬合，由模型計算最高抗氧化活性以及對應(yīng)的不同因素的最佳水平。

（7）抗氧化活性評價

參考郭京波等的實驗方法。測定發(fā)酵后姜油樹脂的DPPH、ABTS自由基清除能力及Fe3+還原能力(FRAP)，計算3種抗氧化活性評價結(jié)果的總和，即總抗氧化活性(TAC)，單位為umolTE(水溶性維生素E)/gGingeroleoresin(姜油樹脂)。

（8）姜油樹脂活性成分高效液相色譜分析

發(fā)酵完成后，將錐形瓶放入真空干燥箱，將培養(yǎng)基蒸干后加入5mL甲醇，超聲萃取5min，第二次與第三次各加入5mL超聲輔助萃取5min，使培養(yǎng)基中的生姜活性物質(zhì)充分溶入甲醇，合并萃取液以甲醇定容至20mL后-20℃儲存，進(jìn)行高效液相色譜分析時取適量用0.22μm的尼龍膜過濾后進(jìn)樣。

用甲醇配制0.2m/mL的6-、8-、10-姜酚以及6-、8-、10-姜烯酚標(biāo)準(zhǔn)品母液，-20℃冰箱儲存。高效液相色譜操作條件:檢測波長280nm，進(jìn)樣體積10uL；流速1.0mL/min；柱溫48℃；運行時間62min；流動相A為乙腈，B為1%的冰醋酸。梯度洗脫條件為:0～10min，45%A；10～20min，65%A；20～40min，95%A；40～50min，100%A；50～62min，45%A。

二、結(jié)果與討論

1、不同根霉菌株發(fā)酵姜油樹脂培養(yǎng)物抗氧化活性的比較

為比較不同根霉菌株發(fā)酵姜油樹脂的能力，選取實驗室保藏的五株根霉進(jìn)行發(fā)酵，即R.oryzaeMG1、R.oryzaeMG4.R.oryzaeMG5、R.tonkinesisDMG、AMG，在20mLPDA液體培養(yǎng)基中添加50μL姜油樹脂，分別接種1%的孢子懸液，28℃震蕩(150r/min)培養(yǎng)4d后，以DPPH法、ABTS法、FRAP法測定抗氧化活性，并計算TAC，結(jié)果如見圖1。

如圖1所示，經(jīng)MG1、MG4、MG5、AMG、DMG發(fā)酵后，姜油樹脂的TAC分別1890.51士5.38μmol/g，1543.38土5.35μmol/g，1494.53士3.98μmol/g，1784.97土8.I6μmol/g，1795.12土6.07μmolg。R.oryzaeMGI活性最高，發(fā)酵力強(qiáng)，且發(fā)酵液氣味清香不刺激，姜油樹脂辛辣的氣味減弱，有淡淡的檸檬香味；MG4、MG5、AMG發(fā)酵液的姜油樹脂辛辣氣味還是比較明顯；DMG發(fā)酵液則會產(chǎn)生令人不愉快的氣味。因此后續(xù)實驗選擇R.oryzaeMG1進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化。

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