②反應(yīng)介質(zhì)中的電解質(zhì)：電解質(zhì)是抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)中不可缺少的成分，它可使免疫復(fù)合物出現(xiàn)可見的沉淀或凝集現(xiàn)象。一般用8.5g／LNaCl溶液作為抗原和抗體的稀釋劑與反應(yīng)介質(zhì)，特殊需要時也可選用較為復(fù)雜的緩沖液。如果反應(yīng)系統(tǒng)中電解質(zhì)濃度低甚至無，抗原抗體不易出現(xiàn)可見反應(yīng)，尤其不易形成沉淀反應(yīng)。如果電解質(zhì)濃度過高，則會出現(xiàn)非特異性蛋白質(zhì)沉淀。

③反應(yīng)溫度：溫度對免疫反應(yīng)的影響顯而易見，溫度過高會使生物分子變性，溫度過低則使生物分子的活性降低或喪失。除了上述較極端的情況以外．抗原抗體的溫度適應(yīng)能力比較強(qiáng)，一般在15～40℃的范圍內(nèi)均可以正常進(jìn)行。在這個范圍內(nèi)，溫度的變化主要影響反應(yīng)速度，較少影響反應(yīng)結(jié)果?？乖贵w反應(yīng)的最適溫度為37℃。

④應(yīng)時間：時問本身不會對抗原抗體反應(yīng)主動施加影響，但實(shí)驗(yàn)過程中觀察結(jié)果的時間不同可能會看到不同的結(jié)果。時間因素主要由反應(yīng)速度來體現(xiàn)，反應(yīng)速度取決于抗原抗體親和力、反應(yīng)類型、反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)溫度、反應(yīng)模式等因素。一般免疫分析固液兩相免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的時間為1～3h。在優(yōu)化條件或反應(yīng)促進(jìn)劑作用下，可縮短免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的時間。均相免疫反應(yīng)比非均相免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的速度快得多，一般37℃下反應(yīng)15rain即可達(dá)平衡。

二、免疫分析方法類型

免疫分析方法有多種不同的分類方式，按抗原抗體反應(yīng)是在固液兩相問還是在單一液相中進(jìn)行和是否需要進(jìn)行固液分離，分為非均相免疫分析和均相免疫分析；按抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的方式不同，免疫分析可分為非競爭型免疫分析和競爭型免疫分析；按抗原(或抗體)是否進(jìn)行標(biāo)記可分為標(biāo)記免疫分析和非標(biāo)記免疫分析。

(一)非均相免疫分析

非均相免疫分析通常在固液兩相中進(jìn)行。以適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物標(biāo)記抗體或抗原，將抗原或抗體固定于適當(dāng)?shù)墓滔噍d體(如聚苯乙烯微孔板)表面，抗原抗體反應(yīng)體系中同時存在液相中游離的標(biāo)記物和固相上結(jié)合的標(biāo)記物，兩相的標(biāo)記物都具有活性。在反應(yīng)平衡后將固相和液相分離，測定固相上結(jié)合狀態(tài)的標(biāo)記物的活性或液相中游離標(biāo)記物的活性，推算待測物的含量。酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA)是目前最常用的非均相免疫測定法。這種測定方法有3種必要的試劑：①包被固相用抗原或抗體，即免疫吸附劑(immunosorbent)；②酶標(biāo)記的抗原或抗體，稱為酶結(jié)合物(conjugate)。

③酶的底物和顯色劑。酶聯(lián)免疫吸附測定法既可用于測定抗原，也可用于測定抗體。由于抗原抗體反應(yīng)在兩相間進(jìn)行，反應(yīng)到達(dá)平衡所需時間長，反應(yīng)平衡后需要進(jìn)行兩相分離，故檢測速度慢。

(二)均相免疫分析

均相免疫分析是在均勻體系(通常在液相)中進(jìn)行的。如可以用適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物(如酶、熒光劑等)標(biāo)記抗體或抗原，利用抗原抗體反應(yīng)形成復(fù)合物后標(biāo)記物的活性(如酶活性)受到抑制或其他信號的變化(如熒光偏振、熒光增強(qiáng)、熒光猝滅等)來檢測抗體或抗原，反應(yīng)后不需要分離結(jié)合的標(biāo)記物和游離的標(biāo)記物，直接測定系統(tǒng)中的標(biāo)記物的活性或相關(guān)信號的變化，來確定結(jié)合的或游離的標(biāo)記物的數(shù)量，從而得到待測抗原或抗體含量的信息。均相免疫分析不僅可以用于蛋白質(zhì)等大分子抗原或抗體的測定，也可用于農(nóng)藥、藥物、激素、毒品、興奮劑等小分子化合物的測定。均相免疫反應(yīng)達(dá)到平衡的速度快，不需要進(jìn)行兩相分離，方法簡便快速。

(三)非競爭型免疫分析

非競爭型免疫分析主要有雙抗體夾心法、間接法和捕獲包被法。

1、雙抗體夾心法檢測抗原病毒等顆粒抗原、蛋白質(zhì)等大分子一般具有多個抗原決定簇，對這類抗原的檢測多采用抗不同抗原決定簇的雙抗體夾心法。

①將特異性抗體包被于固相載體。洗滌除去游離的抗體及雜質(zhì)，封閉固相上未結(jié)合抗體的位點(diǎn)。

②待檢抗原，37℃保溫反應(yīng)，樣品中的抗原與固相抗體結(jié)合，形成固相抗原抗體合物，洗滌除去未結(jié)合的游離物質(zhì)。

③加抗另一抗原決定簇的酶標(biāo)記抗體，37℃保溫反應(yīng)。固相上的抗原抗體復(fù)合物與酶標(biāo)抗體結(jié)合，形成抗體一抗原一酶標(biāo)抗體三元復(fù)合物。徹底洗滌去除未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時固相上結(jié)合的酶標(biāo)抗體量與樣品中被測抗原量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

④加酶的底物和顯色劑，固相三元復(fù)合物上的酶催化顯色劑產(chǎn)生有色產(chǎn)物，樣品中抗原的量與酶促顯色強(qiáng)度呈正比，通過比色測定可對抗原進(jìn)行定性分析和定量分析。

在實(shí)際應(yīng)用中，如抗體的來源為抗血清，包被和酶標(biāo)記用的抗體最好分別來自不同種屬的動物。如應(yīng)用單克隆抗體，一般選擇針對抗原上不同決定簇的單抗，分別用于包被固相和制備酶標(biāo)抗體。這樣的雙抗體夾心法具有很強(qiáng)的特異性，而且可以將受檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗體一起保溫反應(yīng)，進(jìn)行一步法檢測。

2、間接法檢測抗體間接法檢測抗體的原理。用抗原包被固相，加入待檢樣品和酶標(biāo)二抗，待測抗體與固相抗原結(jié)合，酶標(biāo)二抗與待測抗體結(jié)合，通過檢測酶標(biāo)二抗的酶促顯色反應(yīng)來檢測待測抗體。

①將特異性抗原包被于固相。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。

②加待測樣品，37℃保溫反應(yīng)。樣品中的待測抗體與固相抗原結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。洗滌去除樣品中游離的其他成分。

③酶標(biāo)二抗，固相抗原上結(jié)合的待測抗體與酶標(biāo)二抗結(jié)合。洗滌去除游離物。

④加酶的底物和顯色劑顯色，固相上結(jié)合的酶標(biāo)二抗量(酶促顯色反應(yīng)強(qiáng)度)與樣品中待測抗體量在一定范圍內(nèi)呈正相關(guān)。

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