一、高效液相色譜法概述

高效液相色譜法（highperformanceliquidchromatogra：phy，HPLC）是20世紀60年代末期，在經(jīng)典液相柱色譜的基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論和技術(shù)，并加以改進而發(fā)展起來的新型高效分離分析技術(shù)。它是指流動相為液體的色譜技術(shù)，采用高壓泵、小顆粒高效固定相和高靈敏度檢測器，實現(xiàn)了分析速度快、分離效率高和操作自動化。高壓是高效液相色譜法的突出特點，系統(tǒng)內(nèi)壓力可達15～35MPa。由于流動相流經(jīng)色譜柱時，柱內(nèi)填料細密，受到阻力很大，為使流動相攜帶組分迅速通過色譜柱，進入檢測室，就必須對流動相施以高壓。由于化學鍵合固定相的出現(xiàn)，使高效液相色譜柱效能、分離效率大大提高。

高效液相色譜法是農(nóng)藥殘留分析不可缺少的手段。高效液相色譜儀也是農(nóng)藥殘留分析實驗室必備的儀器設(shè)備之一。它解決了熱穩(wěn)定性差、難于氣化、極性強的農(nóng)藥殘留分析問題，隨著高靈敏、通用型檢測器的成功開發(fā)及應用，能勝任絕大多數(shù)農(nóng)藥殘留分析任務。

（一）高效液相色譜法的特點

1、高效：由于使用了細粒度的高效填充柱和均勻填充技術(shù)，高效液相色譜法分離效率極高，柱效能一般可達每米10“理論塔板數(shù)。商品化的還有微型填充柱（內(nèi)徑為lmm）和毛細管液相色譜柱（內(nèi)徑為0．05mm），柱效能超過了每米10。理論塔板數(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)極為有效的分離。

2、高速：由于使用高壓泵輸送流動相、采用梯度洗脫裝置、用檢測器在柱后直接檢測

洗出液成分等原因，高效液相色譜法完成分離分析的時間只需幾分鐘到幾十分鐘，比經(jīng)典液相色譜法要快得多。

3、高靈敏度：紫外線、熒光、電化學、質(zhì)譜等高靈敏度檢測器的使用，使其靈敏度與氣相色譜（GC）相接近。

4、高度自動化：先進的高效液相色譜儀配有計算機，不僅能夠自動處理數(shù)據(jù)、打印分析結(jié)果，而且能夠?qū)x器的全部操作包括流動相、流速、柱溫、檢測器波長的選擇，以及進樣、梯度洗脫方式等進行程序控制，成為全自動化的儀器設(shè)備。

5、不受分析試樣揮發(fā)性和相對分子質(zhì)量的限制：可用于分離高沸點、相對分子質(zhì)量大、熱穩(wěn)定性差的農(nóng)藥殘留及其代謝物的檢測。

一般來講，高效液相色譜法的不足是比氣相色譜法分析成本高（流動相、光源燈、色譜柱的消耗）、故障率高，工效也稍低。

（二）高效液相色譜法的基本類型

液相色譜法主要分為2種類型：平面色譜（薄層色譜、紙色譜）和柱色譜。柱色譜可分為經(jīng)典柱色譜（低壓）和高效液相色譜（高壓）。高效液相色譜法又可分為液固吸附色譜法（1iquidsolidadsrptionchromatogtaphy，LSC）、液液分配色譜法（1iquid-liquidpartitionchromatography，LLC）【主要是鍵合相色譜法（bonded-phasechromatography，BPC）】、離子交換色譜法（ion-excharlgechromatogry，IEC）、空間排阻色譜法（spatialexclLlSlOnchromatography，SEC）。與經(jīng)典的柱色譜法不同，高效液相色譜法采用高壓泵、填充微粒固定相的短柱，并且隨著組分的流出檢測器產(chǎn)生信號并記錄下來。高效液相色譜法原理與經(jīng)典的柱色譜法相同，它的進步主要依賴于色譜儀硬件的開發(fā)。高壓泵能保證當壓力不斷升高的情況下，流量的精度沒有變化，同時有大量的各種類型和規(guī)格的色譜柱供選用。

高效液相色譜法分離模式可分為4種基本形式。建立農(nóng)藥殘留分析的高效液相色譜方法，選用哪種分離模式取決于農(nóng)藥的化學分子結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及對樣品中所含有的干擾物質(zhì)的分離。一般地，高效液相色譜法分析測定農(nóng)藥殘留量以液液分配色譜的鍵合相色譜法最為常用。根據(jù)固定相和流動相相對極性有2種操作方式，一種是正相色譜法（normal—phasechromatography，NPC），另一種是反相色譜法（reverse—phasechromatogra—phv，RPC）。正相色譜法的固定相極性比流動相大，非極性組分先流出色譜柱；隨著流動相極性的提高，被分析的組分保留時間縮短。正相色譜法的優(yōu)點是調(diào)節(jié)分離選擇性時溶劑選擇范圍寬，由于經(jīng)常使用低黏度溶劑，柱壓低，可得到更好的譜圖；其缺點是在某些情況下，流動相配比比例懸殊，平衡時問較長，重現(xiàn)性差，流動相中低濃度的極性污染物會影響分析的靈敏度。

反相色譜法的固定相極性比流動相小。絕大多數(shù)極性組分先流出，隨著流動相極性的增加，被分析的組分保留時間延長。反相高效液相色譜法是農(nóng)藥殘留分析最常用的一種操作方式。

1、液固吸附色譜法：液固吸附色譜法的流動相為液體，固定相為吸附劑。固定相（常用硅膠）通常為沒有包裹固定液的液相色譜法。樣品中各組分因?qū)潭ㄏ啾砻嫖阶饔玫牟町?，得以分離和分析。色譜柱內(nèi)充填固體吸附劑，利用吸附劑表面活性中心進行吸附，試樣不進入固定相內(nèi)部。流動相帶著被測組分進入色譜柱時，吸附劑不僅對不同的組分具有不同的吸附力，而且對流動相分子也具有一定的吸附作用，在吸附劑表面各組分分子之間及各組分分子與流動相分子之間發(fā)生吸附競爭，保留值由這兩個因素決定。

液固吸附色譜法的特點：適合可溶于有機溶劑的非離子型化合物的分離，特別是異構(gòu)體及具有不同極性的取代基的化合物分離；適合于分析非極性和中性化合物，極性化合物可能在色譜柱上產(chǎn)生不可逆的吸附；分析結(jié)果重復性差，柱穩(wěn)定性不好；樣品組分吸附在吸附劑的活性部位有變質(zhì)和損失的可能。這種方法在農(nóng)藥殘留分析上較少應用。

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