(2)高效液相色譜儀：包括：流動相傳輸系統(tǒng)(雙泵梯度洗脫系統(tǒng))、具40μL定量環(huán)的進樣器、保護柱(直接與預填充的C₁₈柱連接)、柱溫箱或柱加熱器(保持柱恒溫)、分析柱[25cm×4.6mm(內(nèi)徑)，填充十八碳硅烷鍵合的粒狀顆粒(ODS，C₁₈)，如EconosphereC₁₈]、柱后光解、衍生單元[包括：用于光解的紫外燈，配備電源，17cm×9mm(外徑)；Teflon光解燈套管，25’×0.5mm(內(nèi)徑)線圈，將Teflon管盤繞在燈上，一端與T形混合器相連，另一端與柱連接；用于OPA-MERC溶液的低流速泵，連接錐形線圈，在泵和0.5mm(內(nèi)徑)Tefton管問作為脈沖阻尼器，與T形混合器相連；T形混合器，不銹鋼，0.25mm孔徑，標準1/16”；反應線圈，10’×0.5mm延遲線圈，一端與T形混合器相連，另一端連接檢測器]、熒光檢測器。

3、測定條件：用單泵或雙泵，以0.002mol/LNaH₂PO₄-甲醇(9∶1)為流動相，0.3mL/min洗柱過夜。流動相改為10％甲醇-水(高效液相色譜級)，1mL/min運行30min。如果使用幾天后色譜基線出現(xiàn)漂移，重復此過程。

保持分析柱溫35℃，用40％甲醇水1mL/min平衡系統(tǒng)，OPA-MERC溶液以0.2mL/min加入T形混合器，OPA-MERC溶液開始流動時，打開紫外燈，穩(wěn)定檢測器。

進檢測溶液或標準溶液后，從40％甲醇一水到80％甲醇一水開始30min的線性梯度洗脫，檢測器激發(fā)波長為340nm，發(fā)射波長為455nm。調(diào)節(jié)檢測器靈敏度，使1.0μg/mL敵草隆溶液40μL的響應為記錄儀或積分儀量程的50％。此條件下敵草隆的洗脫時間約為24min。

每天使用后，用80%甲醇一水沖洗色譜柱20min，色譜柱也可在此重要條件下儲存。

三、苯并咪唑類殺菌劑的多殘留分析

(一)方法原理與適用性

用甲醇提取，提取液酸化后，通過液液分配法轉(zhuǎn)移到二氯甲烷中，然后將提取液堿化。分離殘留，并用配有紫外和熒光檢測器的反相離子對高效液相色譜法進行定量分析。

該方法適于蔬菜和水果中脲基甲酸鹽、多菌靈(由于使用苯菌靈、多菌靈或甲基硫菌靈而得)和涕必靈的殘留測定。紫外檢測器對適用該方法的所有的殘留農(nóng)藥都有響應，而熒光檢測器僅對多菌靈和涕必靈有響應。采用已給的方法分析樣品中的殘留會將樣品中的干擾物質(zhì)與殘留農(nóng)藥一并提取出來。將此方法變動以適用于咖啡豆的分析，但僅限于對多菌靈的分析。

該方法對于所測定的各種農(nóng)藥的定量限都是0.1mg/L。紫外檢測器是非選擇性的，易受作物的干擾，因此定量限可能受某種樣品的影響。對于涕必靈，使用熒光檢測器，在最大吸收波長條件下，該化合物的定量限可至0.01mg/L。

(二)標準溶液配制

分別用丙酮配制25μg/mL的脲基甲酸鹽、多菌靈、涕必靈和甲基托布津的儲備液(不用苯菌靈配制儲備液，是因為該溶液靜置過夜時，完全降解為多菌靈)。標準品溶液在丙酮和高效液相色譜儀(HPLC)流動相中穩(wěn)定。

混標的配制：從已配好的儲備液中，各取出1mL混合后，在30～40℃的微熱下以氮氣流揮發(fā)溶劑至干，然后加入4.0mL甲醇溶解，再加入6.0mL高效液相色譜離子對溶液，

混勻，得各種標準品的最終濃度均為2.5μg/mL。

(三)提取

稱取50g已切碎的樣品于500mL具塞錐形瓶中，加入100mL甲醇，在機械振蕩器上振蕩10min。如分析香蕉(整個或僅果肉部分)，則在機械振蕩器上振蕩之前，先用手用力將其搖勻。

用裝有濾紙的布氏漏斗將上述溶液過濾至真空濾瓶中，然后用50mL甲醇沖洗錐形瓶和濾紙上的殘渣。轉(zhuǎn)移濾液于500mL分液漏斗中，加10mL1mol/L鹽酸和100mL1％NaCl溶液，混勻，冷卻。每次用100mL二氯甲烷劇烈振蕩提取濾液兩次，每次提取1min。將二氯甲烷層過約70g無水硫酸鈉柱(脫水)，用圓底燒瓶收集柱流出液。甲醇水溶液層仍保存在分液漏斗中，留待以后提取用。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉柱，并收集在圓底燒瓶中。用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在≤30℃的水浴中，揮發(fā)圓底燒瓶中的二氯甲烷，至干。加入4mL甲醇溶解提取物，該提取物中含有脲基甲酸鹽、甲基硫菌靈、涕必靈和多菌靈。

將分液漏斗中的甲醇水溶液層全部轉(zhuǎn)移到燒杯中，用水沖洗分液漏斗兩次，每次10mL，洗液倒入燒杯中。

用5mol/L和1mol/L的NaOH(如需要，可用1mol/L鹽酸)調(diào)節(jié)燒杯中提取液的pH至7.5～8。在調(diào)節(jié)溶液的pH時，切勿使溶液呈強堿性。

再將燒杯中溶液倒入分液漏斗中，用二氯甲烷激烈振蕩提取兩次，每次100mL，每次提取1min。

將二氯甲烷層過約70g無水硫酸鈉柱，用圓底燒瓶接收柱淋出液(前面用于干燥二氯甲烷的無水硫酸鈉柱可再次使用)。用50mL二氯甲烷淋洗硫酸鈉柱，并收集在圓底燒瓶中。

在真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上，揮發(fā)二氯甲烷提取液至干，用4mL甲醇溶解提取物。至此，已將大部分的多菌靈和涕必靈提取出。

(四)凈化

本方法目前沒有可以參考的凈化方法。

(五)測定

1、原理苯并咪唑類殺菌劑的殘留采用離子對反相色譜進行分析。多菌靈和涕必靈在酸性流動相中被離子化與由癸烷基磺酸鈉產(chǎn)生的帶負電荷的反離子形成離子對，以控制高效液相色譜系統(tǒng)的選擇性，并從樣品提取物中的干擾物中分離出待分析物。根據(jù)反相色譜的原理，在該條件下的色譜柱中呈中性的甲基脲酸鹽和甲基硫菌靈將不受流動相改變的影響。

紫外檢測器和熒光檢測器均對多菌靈和涕必靈有響應，紫外檢測器還對甲基硫菌靈和脲基甲酸鹽響應。

2、儀器

儀器包括：流動相輸送系統(tǒng)(為恒流泵)、進樣器(帶有≥25μL定量環(huán)的自動樣品進樣閥)、色譜柱[25cm×4.6mm(內(nèi)徑)，與硅鍵合的C₁₈柱，粒徑5μm，適于大多數(shù)堿性化合物的分析]、與色譜柱配套的保護柱(與硅鍵合C₁₈柱的填料相同)、柱溫箱(可容納保護柱和色譜柱)、可變波長紫外檢測器或二極管陣列檢測器(且裝有約8μL的流通池)、記錄儀(譜線記錄儀或適于各種檢測的計算積分儀)。

3、測定條件

(1)流動相：離子對溶液和甲醇以65∶35的比例混合(切勿用泵混合流動相，因為混合時的放熱反應所產(chǎn)生的氣泡使泵不能穩(wěn)定地工作)。在使用前，要邊用磁力攪拌子劇烈攪動溶液，邊通人氦氣進行脫氣。

(2)離子對溶液：離子對溶液中含4.1mmol/L1-癸烷磺酸鈉鹽(純度為98％)。移取7.0mL磷酸(85%)于200mL高效液相色譜純的水中，在該溶液中加1.0g1-癸烷磺酸鈉鹽。再移取10.0mL三乙胺(99％)于溶液中，并用高效液相色譜純的水稀釋至1L。過＜1μm的微孔濾膜(溶液的pH應約為2.4)。

(3)甲醇：甲醇須經(jīng)全玻璃蒸餾器蒸餾。

(4)水：水為高效液相色譜純的水，市售或采用制備蒸餾水、去離子水的純水裝置制得。該水的電阻值務必＞12MΩ/cm。

(5)檢測器的連接：將熒光檢測器與紫外檢測器串聯(lián)在一起。設柱溫箱溫度為40℃，用流動相以1.5mL/min的流速平衡系統(tǒng)30min以上或直到所得4個分析物的保留時間是一個常量。

(6)色譜柱：如長時間(≥24h)不用，則用50％的甲醇-水溶液洗色譜柱；如短期內(nèi)不用，則用低流速(0.10～0.2mL/min)的流動相清洗色譜柱以防止鹽沉積。

為了去除柱中殘留量高的樣品組分，在50％的甲醇一水溶液洗色譜柱后，用甲醇洗色譜柱。在輸人流動相之前，再用50％的甲醇-水溶液洗色譜柱。加入甲醇前，必須用水沖洗色譜柱中的流動相，以避免鹽沉積可能會堵塞系統(tǒng)。

(7)紫外檢測器紫外檢測器吸收波長開始設為250nm，在淋洗完脲基甲酸鹽后，將波長設為280nm，并將基線調(diào)至零起始線測定甲基硫菌靈、多菌靈和涕必靈。調(diào)整檢測器和(或)記錄儀的靈敏度，使每個標準品(62.5ng/25uL)響應均為滿刻度的40％～70％。

(8)熒光檢測器：熒光檢測器的激發(fā)波長設為280nm(狹縫寬為20nm)，發(fā)射波長設為310nm(狹縫寬為10nm)。調(diào)整檢測器、衰減和(或)記錄儀的靈敏度，使62.5ng/25μL的多菌靈響應為滿刻度的60％～80％，而在此條件下，62.5ng/25μL涕必靈的響應則為滿刻度的40％～50％。

另外，還可使用可程序改變波長熒光檢測器和可程序改變波長或二極管陣列紫外檢測器，以在最佳波長條件下進行殘留測定。

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