菌落的概念

菌落（colony）:細(xì)菌在固體培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后生長(zhǎng)繁殖而形成的能被肉眼所識(shí)別的生長(zhǎng)物集落，它是由數(shù)以萬計(jì)的相同細(xì)菌集聚而成的。（報(bào)告單位：CFU）

菌落總數(shù)的定義： 樣品經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后(如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度和時(shí)間、pH、需氧性質(zhì)等)，所得1mL(g)檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果包括一群在方法規(guī)定的條件下生長(zhǎng)的嗜中溫的需氧和兼性厭氧菌。

儀器與耗材

樣品稀釋液：

1、 磷酸鹽緩沖溶液（pH=7.2±0.2）（建議使用）

2、0.85%生理鹽水

培養(yǎng)基： 平板計(jì)數(shù)瓊脂（PCA）（培養(yǎng)基的質(zhì)控及驗(yàn)收）

檢驗(yàn)步驟

樣品稀釋

固體和半固體樣品：稱取25g樣品至盛有225 mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000 r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225 mL稀釋液的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1:10的樣品勻液。

液體樣品：以無菌吸管吸取25mL樣品至盛有225mL磷酸鹽緩沖稀釋液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1:10的樣品勻液。

梯度稀釋
用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1:100的樣品勻液。

按上述操作制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無菌吸管或吸頭。

培養(yǎng)

如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL）。

瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。 

結(jié)果計(jì)數(shù)

可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（Colony Forming Units，CFU ）表示。

選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。 

結(jié)果計(jì)算表述一
若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值再將平均值乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)，作為每g(ml)中的菌落總數(shù)結(jié)果。

計(jì)算范例1：

 計(jì)算：（164+160）/2×10² ＝16200＝16000  

結(jié)果計(jì)算表述二

若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按公式（1）計(jì)算：

N——樣品中菌落數(shù)；

ΣC——平板（含適宜范圍菌落數(shù)的平板）菌落數(shù)之和；

n₁——第一稀釋度（低稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

n₂——第二稀釋度（高稀釋倍數(shù)）平板個(gè)數(shù)；

d——稀釋因子（第一稀釋度）。 

計(jì)算范例2：

結(jié)果計(jì)算表述三

若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于300 CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

計(jì)算范例3：

計(jì)算：（320+312）/2×103 ＝316000＝320000

結(jié)果計(jì)算表述四

若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于30 CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

計(jì)算： （16+15）/2×10 ＝155＝160

結(jié)果報(bào)告

菌落數(shù)小于100 CFU 時(shí)，按“四舍五入”原則修約，以整數(shù)報(bào)告。    

例:（78+77）/2×100  ＝77.5（78）    

報(bào)告：菌落總數(shù)（ CFU/mL ）78

大于或等于100時(shí)，前第3位數(shù)字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數(shù)字，后面用0代替位數(shù)來表示結(jié)果；也可以用10的指數(shù)形式來表示，此時(shí)也按“四舍五入”原則修約采用兩位有效數(shù)字。

例：（228+217）/2×10¹＝222.5（223）×10¹ ＝2200    

報(bào)告：菌落總數(shù)（ CFU/mL ）2200（或2.2×10³ ）

若所有平板上為蔓延菌落而無法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無效，需重新檢測(cè)。

菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示，報(bào)結(jié)果：  

稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。

注意事項(xiàng)

1.實(shí)驗(yàn)過程中應(yīng)設(shè)置空白對(duì)照。如空白對(duì)照有菌落生長(zhǎng)，則本次實(shí)驗(yàn)無效，并對(duì)稀釋液、吸管、平皿、培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)環(huán)境等進(jìn)行污染來源分析。

2.實(shí)驗(yàn)中所使用的實(shí)驗(yàn)耗材必須是完全滅菌的，重復(fù)使用的耗材應(yīng)徹底洗滌干凈，不得有殘留物。

3.為保證對(duì)計(jì)數(shù)培養(yǎng)基高壓滅菌的效果，建議每瓶培養(yǎng)基高壓時(shí)，體積不宜超過400mL 高壓滅菌后，培養(yǎng)基中的瓊脂會(huì)分散在底部，應(yīng)搖勻后使用在培養(yǎng)箱中，為防止中間平皿過熱，高度不得超過6個(gè)平皿。