1 Introduction

副溶血性弧菌是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，常見(jiàn)于蝦、魚、貝類等海產(chǎn)品中，極易引起腹瀉。在中國(guó)和印度的沿海地區(qū)和非沿海大城市，該細(xì)菌已成為主要的食源性病原體。副溶血性弧菌的致病性，包括溶血活性、腸毒性和細(xì)胞毒性，主要?dú)w因于毒力基因tdh和trh的存在，它們編碼耐熱性直接溶血素（TDH）和TDH相關(guān)溶血素（TRH）。

蝦以其獨(dú)特的口感和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，成為世界上最美味、最受歡迎的食物之一。對(duì)于消費(fèi)者來(lái)說(shuō)，其新鮮度被認(rèn)為是最重要的因素，因此，冷凍是最廣泛使用的保持其新鮮度的工藝。在冷凍過(guò)程中，副溶血性弧菌會(huì)經(jīng)歷洗滌、冷凍、解凍等應(yīng)激過(guò)程。為了減輕這些脅迫，該病原菌啟動(dòng)多種防御策略，如產(chǎn)生冷休克蛋白，然而攜帶tdh和/或trh基因的致病株可以顯著增加其對(duì)凍結(jié)條件的抵抗力。因此，在冷凍蝦制品中帶有tdh和/或trh基因的副溶血性弧菌是值得關(guān)注的食品安全問(wèn)題。

此外，許多報(bào)道指出，在冷凍過(guò)程中，會(huì)出現(xiàn)副溶血性弧菌轉(zhuǎn)變?yōu)榭纱婊畹豢膳囵B(yǎng)（VBNC）狀態(tài)。VBNC細(xì)胞在固體培養(yǎng)基上通常會(huì)失去培養(yǎng)能力，但在適當(dāng)?shù)臈l件下仍然具有功能活性，并具有潛在的致病性，在合適的條件下可以復(fù)蘇。近年來(lái)，食品行業(yè)一直在關(guān)注致病菌的VBNC細(xì)胞可能會(huì)逃避檢測(cè)，并仍然保持毒性。然而，很少有研究關(guān)注食品加工過(guò)程中對(duì)VBNC細(xì)胞的誘導(dǎo)及其致病性的變化。

近期，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院在本文中測(cè)定了中國(guó)對(duì)蝦在冷凍加工過(guò)程中副溶血性弧菌的毒力變化，包括數(shù)量、VBNC狀態(tài)、毒素和毒力基因等，以了解該病原菌在加工脅迫下的致病性和分子適應(yīng)情況，為今后的凍蝦加工提供科學(xué)依據(jù)和支持。

2 Results and Discussion

在冷凍過(guò)程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847分別降低了0.90（lg (CFU/mL)）和1.55（lg (CFU/mL)）（圖1）。其中，瀝干階段降低最顯著，分別為0.55（lg (CFU/mL)）和1.45（lg (CFU/mL)）。在噴淋階段，他們的數(shù)量也出現(xiàn)下降，但只有ATCC17802呈顯著下降。在速凍階段兩株細(xì)菌數(shù)量變化都沒(méi)有明顯差異。而在渡冰衣階段，兩株菌的數(shù)量均略有上升趨勢(shì)，分別為0.30（lg (CFU/mL)）和0.26（lg (CFU/mL)），這表明副溶血性弧菌在長(zhǎng)期的冷凍過(guò)程中也能生長(zhǎng)。

為了檢測(cè)對(duì)蝦冷凍加工過(guò)程中VBNC狀態(tài)的副溶血性弧菌，從5個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)采集細(xì)菌，使用LIVE/DEAD® BacLightTM細(xì)菌活力試劑盒染色，用激光共聚焦顯微鏡觀察，并將染色結(jié)果用ImageJ軟件對(duì)綠色活菌計(jì)數(shù)。加工過(guò)程中，兩株菌在速凍前迅速減少，但在之后開(kāi)始緩慢增加，這與平板計(jì)數(shù)結(jié)果不同。在瀝干階段細(xì)菌數(shù)量明顯下降，說(shuō)明清洗能夠減少附著在對(duì)蝦上的副溶血性弧菌。然而在共聚焦激光顯微鏡觀察下，在噴淋階段細(xì)菌的減少是因?yàn)楦比苎曰【呀?jīng)進(jìn)入了VBNC狀態(tài)，這說(shuō)明在制作凍被時(shí)，細(xì)菌開(kāi)始逐漸進(jìn)入VBNC狀態(tài)

在對(duì)蝦冷凍加工過(guò)程中，副溶血性弧菌ATCC17802和ATCC33847菌株接種到中國(guó)對(duì)蝦后，在我妻氏血瓊脂平板上產(chǎn)生清晰的透明溶血環(huán)。與此同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照組（接種副溶血性弧菌菌液）和陰性對(duì)照組（對(duì)蝦中未接種副溶血性弧菌），均很難在我妻氏血瓊脂上觀察到類似溶血環(huán)。這些結(jié)果表明，副溶血性弧菌接種中國(guó)對(duì)蝦后，這些菌株的毒力會(huì)變的更強(qiáng)。

隨后對(duì)凍蝦加工過(guò)程中副溶血性弧菌總?cè)苎钚赃M(jìn)行測(cè)定。副溶血性弧菌ATCC17802的溶血活性較低，但在冷凍過(guò)程中仍從OD570值的0.23緩慢上升至0.35。但是副溶血性弧菌ATCC33847，其溶血活性迅速增加2倍以上（OD570值從0.49到1.08），并從噴淋解凍階段后繼續(xù)增加。這些結(jié)果表明，這些副溶血性弧菌菌株即使在冷凍的環(huán)境中仍然具有毒性。

兩株菌的tlh基因的相對(duì)表達(dá)量在加工過(guò)程中都表現(xiàn)出相似的增長(zhǎng)規(guī)律，說(shuō)明基因表達(dá)的結(jié)果是可靠的。在冷凍過(guò)程中，副溶血性弧菌ATCC17802的trh基因相對(duì)表達(dá)量逐漸下調(diào)，在瀝干和噴淋解凍階段比前一階段減少了將近一半。然而在噴淋階段后，相對(duì)表達(dá)量開(kāi)始上調(diào)，這表明TRH仍能在冷凍環(huán)境下合成，但是會(huì)在解凍過(guò)程通過(guò)水淋導(dǎo)致流失。副溶血性弧菌ATCC33847的tdh則剛好相反，相對(duì)表達(dá)量逐漸上調(diào)，并在渡冰衣階段增長(zhǎng)到接種階段兩倍。這些結(jié)果表明，即使在冷凍溫度下，TRH和TDH仍然可以合成，這與總?cè)苎钚栽囼?yàn)的結(jié)果基本一致。

3 Conclusion

在整個(gè)加工過(guò)程中，兩株副溶血性弧菌的數(shù)量均未大幅度減少，僅分別降低了1.55（lg (CFU/mL)）和0.90（lg (CFU/mL)）。其中，在清洗和噴灑階段，細(xì)菌數(shù)量有顯著減少，但這是由不同的因素造成的。通過(guò)SYTO9和PI染色，共聚焦激光掃描顯微鏡顯示，水洗是洗滌階段細(xì)菌減少的主要原因，而菌株進(jìn)入VBNC狀態(tài)是噴淋解凍階段平板計(jì)數(shù)細(xì)菌數(shù)量減少的原因。副溶血性弧菌產(chǎn)生的溶血毒素，在接種到蝦中后毒性增強(qiáng)，且在整個(gè)過(guò)程中都能檢測(cè)到，尤其是在速凍階段，其含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他階段。tdh和trh基因表達(dá)變化也表現(xiàn)出與溶血毒性試驗(yàn)相似的趨勢(shì)。其中tdh基因在凍結(jié)過(guò)程中不斷增加，在渡冰衣階段幾乎達(dá)到了2倍的表達(dá)水平，而trh基因表達(dá)水平較低，不到接種前表達(dá)水平的一半。

相關(guān)鏈接：副溶血性弧菌，菌株，腸毒素，弧菌，細(xì)胞，偉業(yè)計(jì)量

本文章來(lái)源于——《食品科學(xué)網(wǎng)》，如有版權(quán)問(wèn)題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系