2.2.2堿溶液濃度和水解時間的選擇

以NIST 1849a配方乳粉質(zhì)控樣作為研究對象，使用2、3和4 mol/L 3種濃度的LiOH溶液分別水解18、20和22 h，測定的色氨酸含量如圖4所示。由圖中數(shù)據(jù)可知，2和3 mol/L堿溶液經(jīng)22 h仍沒有水解完全，而4 mol/L的LiOH在18 h已經(jīng)水解完全，繼續(xù)水解20和22 h沒有明顯變化，為了保證充分的水解，以準(zhǔn)確測定總色氨酸的含量，選擇4 mol/L LiOH水解溶液、水解時間20 h作為最佳的水解條件

2.2.3水解溫度的確定

為考察水解溫度的影響，設(shè)計了100、110、120 ℃ 3個水解溫度進(jìn)行考察，結(jié)果見圖5。由圖中數(shù)據(jù)可見，110和120 ℃水解結(jié)果在18和20 h的時候無顯著差異，但120 ℃在22 h以后出現(xiàn)了明顯的下降；而在100 ℃條件下，樣品水解至22 h依然未能水解完全，且增加反應(yīng)時間后，色氨酸濃度反而出現(xiàn)了下降，通過色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品的堿水解實驗驗證，發(fā)現(xiàn)水解時間過長，游離色氨酸會部分被破壞，故本方法選擇110 ℃作為水解溫度。

2.2.4堿水解法內(nèi)標(biāo)確定

由于堿水解過程溫度高，時間長，對不同的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗發(fā)現(xiàn)色氨酸長時間在高溫高濃度的堿中會有一定程度的損失，而且不同基質(zhì)中色氨酸的損失不同。試驗增加了在堿水解過程中充氮保護(hù)的措施，結(jié)果表明色氨酸的損失在充入氮?dú)?/span>保護(hù)后略有改善，但使用充氮保護(hù)下堿水解的方法測試質(zhì)控樣NIST1849a，結(jié)果僅為168 mg/100 g，不能達(dá)到滿意的結(jié)果；參考標(biāo)準(zhǔn)GB/T 15400—2018 《飼料中色氨酸的測定》在水解前對樣品進(jìn)行除脂，試驗結(jié)果表明除脂僅對水解液的外觀有所改變，對測定結(jié)果沒有改善。因此在優(yōu)化前處理方法無法有效降低色氨酸損失的前提下，采用色氨酸的結(jié)構(gòu)類似物作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行同步校正，提高定量準(zhǔn)確性的同時簡化樣品處理步驟。本方法將5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸作為研究對象來考察其作為內(nèi)標(biāo)物定量堿水解方法測定色氨酸含量的可行性。

先后選擇了NIST質(zhì)控樣1849a和1869作為研究對象，分別加入5-甲基-色氨酸和α-甲基-色氨酸內(nèi)標(biāo)后，進(jìn)行堿水解。表2不同定量方式和不同內(nèi)標(biāo)的定量結(jié)果顯示，相同條件下以α-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)得到的2個質(zhì)控樣的含量均能滿足明示的范圍，而5-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)得到的結(jié)果偏高，外標(biāo)法定量的結(jié)果則達(dá)不到質(zhì)控樣的明示下限。以α-甲基-色氨酸作為內(nèi)標(biāo)來定量能得到更為準(zhǔn)確的結(jié)果。

2.3方法學(xué)驗證

2.3.1線性范圍和定量限

準(zhǔn)確吸取色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）20、100和500 µL、1.0、2.0和5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入100 µL內(nèi)標(biāo)（1 mg/mL）工作液，用水定容至刻度，混勻后得到濃度分別為0.2、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，分別將標(biāo)準(zhǔn)系列工作液按照濃度由低到高的順序注入液相色譜儀中，測得相應(yīng)色譜峰的峰面積，以系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度為橫坐標(biāo)，以目標(biāo)化合物的峰面積與內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。相關(guān)系數(shù)r＞0.999，覆蓋方法定量限和常見樣品的含量水平，線性良好。將S/N＞10且能準(zhǔn)確定量的最低濃度點(diǎn)計算出的含量確定為方法的定量限。結(jié)果見表3。

2.3.2方法準(zhǔn)確度和精密度

試驗選取代表性樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，樣品分別為嬰幼兒配方乳粉、乳蛋白部分水解樣品和氨基酸配方樣品，對樣品進(jìn)行平行試驗得出本底值后再對每個樣品做0.5倍、1倍和2倍本底值水平的加標(biāo)試驗，以回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）評價方法的準(zhǔn)確度和精密度。試驗樣品回收率和RSD見表4。樣品的平均回收率在92.5%~97.4%之間，RSD差均小于3.11%。將試驗樣品選取4家機(jī)構(gòu)進(jìn)行驗證，實驗室間RSD小于6.7%，顯示了良好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.3.3實際樣品應(yīng)用

采用開發(fā)的方法對21個不同種類樣品進(jìn)行測定。樣品包括不同品牌嬰幼兒配方乳粉8個、乳蛋白部分水解配方食品4個、乳蛋白深度水解配方食品4和氨基酸配方食品5個。樣品中色氨酸含量范圍為170~315 mg/100 g，回收率92%~98%，均符合GB 10765—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰兒配方食品》中對色氨酸含量的要求。

3.結(jié)論

本研究以α-甲基-色氨酸為內(nèi)標(biāo)物，采用堿水解-高效液相色譜法測定了乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中的色氨酸。內(nèi)標(biāo)法較好的校正了水解過程中高溫、高濃度堿溶液和不同基質(zhì)在處理過程中對色氨酸的影響，同時省略了前處理過程中充氮?dú)獗Ｗo(hù)等步驟，對該方法進(jìn)行方法學(xué)驗證，也能得滿意的準(zhǔn)確度和精密度。應(yīng)用于不同種類的樣品和質(zhì)控樣中目標(biāo)物的測定均符合明示值，表明該方法操作簡單、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適用于乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的準(zhǔn)確定性定量，可為企業(yè)生產(chǎn)和有關(guān)部門監(jiān)管提供理論支撐。

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