以α-甲基-色氨酸為內(nèi)標(biāo)物，建立了堿水解-高效液相色譜法測定嬰幼兒配方乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸含量的方法。樣品經(jīng)堿溶液水解，C18柱分離，熒光檢測器檢測；內(nèi)標(biāo)法定量，校正水解過程色氨酸的損失，降低基質(zhì)之間的差異，提高定量結(jié)果的準(zhǔn)確性；在常見樣品含量水平加標(biāo)，樣品的回收率為92.5%~97.4%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<3.11%，實(shí)驗(yàn)室間偏差＜6.7%。方法操作簡單、準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好，適用于嬰幼兒配方乳粉及特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品中色氨酸的準(zhǔn)確定性定量。

色氨酸是人體的必需氨基酸之一，參與機(jī)體蛋白質(zhì)的合成和代謝調(diào)節(jié)，它是煙酸、5-羥色胺、褪黑激素等生物活性物質(zhì)的前體物，影響蛋白質(zhì)、糖類和脂肪等營養(yǎng)物質(zhì)的代謝。當(dāng)人體缺乏色氨酸時(shí)會(huì)引起皮膚疾患、玻璃體退化及心肌纖維化等病癥。相較于成人，嬰幼兒時(shí)期生長發(fā)育迅速，在該時(shí)期色氨酸及其代謝物對(duì)大腦的發(fā)育和對(duì)進(jìn)食-飽足、睡眠-覺醒規(guī)律等神經(jīng)行為調(diào)節(jié)發(fā)展至關(guān)重要，因此必須保證嬰兒食品中營養(yǎng)素的含量和質(zhì)量。對(duì)于消化吸收障礙、代謝紊亂或特定疾病狀態(tài)的兒童對(duì)營養(yǎng)素或膳食有更為特殊的需求。

嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)用途嬰兒配方食品作為特定人群的食物來源，其營養(yǎng)成分組成在國家標(biāo)準(zhǔn)中都有特殊規(guī)定，對(duì)色氨酸的含量和添加形式都有相關(guān)的要求，但缺乏相應(yīng)的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)。目前，測定色氨酸的檢測方法有包括分光光度法、電化學(xué)法、氨基酸分析儀法、高效液相色譜法、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法和離子色譜法等，液相色譜方法的特異性和定量準(zhǔn)確性均有優(yōu)勢。色氨酸多以蛋白質(zhì)的形式存在于樣品中，需水解為游離態(tài)后才能測定。目前通常采用的堿水解方法長時(shí)間在高溫、高濃度堿液條件下進(jìn)行，色氨酸有一定損失，且在不同的基質(zhì)中色氨酸的損失程度不完全一致。

本研究在經(jīng)典堿水解方法的基礎(chǔ)上引入結(jié)構(gòu)與色氨酸相似的內(nèi)標(biāo)物α-甲基色氨酸，以內(nèi)標(biāo)法定量，使同一水解條件同時(shí)適用于嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)配方嬰幼兒配方食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方）中色氨酸含量的準(zhǔn)確測定。

1材料與方法

1.1 材料與試劑

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（C11H12N2O2，CAS號(hào)：73-22-3，純度：99.7%），德國Dr.Ehrenstorfer公司；α-甲基-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（C12H14N2O2，CAS號(hào)：110117-83-4，純度：98%），上海甄準(zhǔn)生物科技有限公司；甲醇(色譜純)，美國Merck公司；醋酸銨（色譜純），美國Fisher Chemical公司；乙酸（色譜純），F(xiàn)isher Chemical公司色；氫氧化鋰（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鹽酸（分析純），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚四氟乙烯材質(zhì)水解管，帶螺紋口外蓋，內(nèi)襯聚四氟乙烯密封墊；水相微孔濾膜（0.22 μm，上海安譜）；NIST配方乳粉質(zhì)控樣1849a（（184±10）mg/100g, k=2）、NIST配方乳粉質(zhì)控樣1869（（228±24）mg/100g, k=2）、嬰幼兒配方乳粉和特殊醫(yī)學(xué)配方嬰幼兒食品（乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方和氨基酸配方），均為市售。實(shí)驗(yàn)室用水符合 GB /T 6682 規(guī)定的一級(jí)水要求。

1.2標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

色氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取10.0 mg色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解后定容至100 mL；內(nèi)標(biāo)工作液（1 mg/mL）：稱取10 mg α-甲基-色氨酸標(biāo)準(zhǔn)品用水溶解后定容至10 mL。

1.3儀器與設(shè)備

Thermo Ultimate 3000高效液相色譜儀配有熒光檢測器，美國Thermo Fisher公司；KQ-800DE超聲清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；MS204TS電子天平，瑞士梅特勒公司；DHG-9243BS-Ⅲ電熱干燥箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；MS 3 basic渦旋混合器，德國IKA公司；IQ 7000超純水儀；美國 Millipore 公司。

1.4樣品前處理

準(zhǔn)確稱取混合均勻的固體試樣200 mg（精確到1 mg）于配有密封墊的具塞螺紋口聚四氟乙烯離心管中，依次加入0.5 mL內(nèi)標(biāo)工作液、5 mL氫氧化鋰溶液（4 mol/L），渦旋混勻后于超聲波振蕩器中震蕩5 min，保證樣品完全溶解后，置于110 ℃烘箱中水解20 h。取出水解管，待冷卻至室溫后，用鹽酸溶液（4 mol/L）調(diào)pH值至3~8，將水解液全部轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中并用水定容，混勻后經(jīng)0.22 μm水相微孔濾膜過濾備用。

1.5儀器條件

色譜柱：Xbridge C18(3.5 μm, 150 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相：A為乙酸銨溶液（10 mmol/L，pH =4.0），B為甲醇，梯度洗脫，洗脫程序見表1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；熒光檢測器激發(fā)波長280 nm，發(fā)射波長346 nm。梯度洗脫程序見表1，每次進(jìn)樣前初始流動(dòng)相比例平衡5 min。

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