丹參是唇形科植物丹參(SalviamiltorhizaBge)的干燥根和根莖。味苦；性微寒。功能主治：通經(jīng)止痛，活血化瘀，涼血消癰，清心除煩。用于癥瘕積聚，胸痹心痛，心煩不眠，熱痹疼痛，痛經(jīng)經(jīng)閉，月經(jīng)不調(diào)，瘡瘍腫痛。丹參的活性成分有脂溶性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮Ⅱ-A、隱丹參酮和水溶性成分丹參素、原兒茶醛等。其中丹參酮(tanshinone)類作為丹參的主要有效成分，有較強的生理活性以及廣泛的藥理作用，包括心血管藥理作用、天然抗氧化、性激素作用、抗腫瘤作用等。疲勞又稱疲乏，是一種主觀不適感覺，但客觀上會在同等條件下失去其完成原來所從事的正常工作和活動的能力?，F(xiàn)在社會加快的生活節(jié)奏和增大的社會競爭及家庭壓力，使疲勞人群不斷增多，且程度更加嚴重，發(fā)生后如果不及時緩解，就會逐漸積累，最終導致機體的神經(jīng)、內(nèi)分泌及免疫等系統(tǒng)調(diào)節(jié)失常，嚴重的會導致器質(zhì)性病變，嚴重影響人身心健康。因此對于抗疲勞藥物的研究意義重大。一些文獻和專利報道了關于丹參酮的提取分離，但提取方法復雜且成本高，限制了對丹參酮的深入研究。本實驗利用大孔樹脂對丹參提取物進行分離優(yōu)化，此方法環(huán)保衛(wèi)生、節(jié)約成本。大孔吸附樹脂色譜的原理是吸附和分子篩原理相結(jié)合。近年來該技術已廣泛應用于中藥新藥研發(fā)和中藥制劑研發(fā)生產(chǎn)中，基本已成為分離中藥化學成分的主要手段之一，具有選擇性好，吸附速度快，分離處理量大，可再生重復使用節(jié)約成本等特點。

一、材料與儀器

1、材料、試劑

丹參根，山東省泰安市化馬灣20171121，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學李佳教授鑒定為丹參根；丹參酮標準品HPLC＞=98%，100mg/瓶；無水乙醇，試劑均為分析純；水為蒸餾水或同等純度的水；大孔樹脂D-290、D-301、D-101、D-201、AB-8。美國洋參沖劑(規(guī)格：4g/袋，金日制藥有限公司，批號：20170823)。肝糖原測定試劑盒，血乳酸測定試劑盒，血清尿素氮測定試劑盒，上海加科生物科技有限公司。

2、儀器

紫外-可見分光光度計，UV2550，日本島津公司；HH-S4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國宇儀器制造有限公司；DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，鄭州南北儀器設備有限公司；TDL-80-2B離心機價上海安亭科學儀器有限公司；YP-B電子天平，上海光正醫(yī)療儀器有限公司；YRE-501旋蒸儀，鞏義市予華儀器有限公司；Agilent1260型高效液相色譜儀(Agilent1260四元泵，DAD檢測器，LC1260色譜工作站)；TC-C18色譜柱(5μm，4.6mmx200mm)；游泳玻璃缸，自制；精密移液器、一次性吸頭。

3、實驗動物

清潔級昆明小鼠，雄性，體重20g～24g；由北京維通利華實驗動物技術有限公司上海分公司提供，生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)20012-0005。

二、單因素提取優(yōu)化工藝

1、丹參提取液的制備(以最佳條件為例)

稱取一定量丹參根，用植物粉碎機粉碎，過40目篩。稱量200.0g置于2000mL圓底燒瓶中。加入8倍量(1600mL)85%乙醇，水浴鍋在70℃下回流提取3h，抽濾，濾液保存，濾渣重新倒入圓底燒瓶，重復以上實驗2次后，濾液保存，濾渣廢棄。將部分濾液置于圓底燒瓶中，溫度設置為50℃，轉(zhuǎn)速為30r/min，進行旋蒸，濃縮濾液至1.3～1.35g/mL。測量濃縮后的濾液體積，向其中加入3倍量熱水，將該溶液置于50mL離心：管中進行離心，時間10min，轉(zhuǎn)速4000r/min。離心停止后觀察上清液顏色，重復上面步驟至上清液為無色，離心留下沉淀，用藥匙將沉淀轉(zhuǎn)移到蒸發(fā)皿中。沉淀在60℃水浴鍋內(nèi)蒸干，得到丹參提取物，稱量沉淀質(zhì)量，備用。

2、影響丹參提取液中丹參酮純度的因素

回流時乙醇濃度、回流時間、回流溫度均可影響丹參酮純度。

回流乙醇濃度確定：75%、85%、95%。

回流溫度確定：60℃、70℃、80℃。

回流時間確定：2h、3h、4h。

按照表1條件進行實驗。

3、大孔樹脂的篩選

（1）樹脂的預處理

新樹脂首先用3mol/LNaOH浸泡8h，接著用水清洗至中性，再用3mol/L的HCl浸泡8h，用水洗至中性，再用95%乙醇浸泡24h，最后用水洗到樹脂無醇味。

（2）大孔吸附樹脂型號的選擇

準確稱取預處理過的大孔樹脂各1.0g，分別加入100mL丹參提取液置于250mL錐形瓶中，在水浴搖床(25℃、100～120r/min)上振蕩24h，測定吸附平衡后溶液中丹參酮的含量。接著用蒸餾水洗樹脂三次來除去表面殘留的樣液，再加入50mL70%乙醇解吸24h后計算解吸率。以大孔樹脂的解析率、吸附率為指標，選擇最優(yōu)的大孔樹脂。

吸附能力=(Co-Cv)xV/W

吸附率(%)=(Co-C₁)/Cox100

解析率(%)=(C₂xV₂)/[(Co-C₁)xVo]x100

式中：Co為初始樣液濃度，

C₁為平衡濃度，

C₂為洗脫液濃度，

Vo為初始樣液體積，

V₂為洗脫液體積，

M為樹脂干重。

4、大孔樹脂優(yōu)化丹參酮的條件優(yōu)化

（1）吸附劑和上樣濃度的選擇

將8份預處理好的D101大孔吸附樹脂濕法裝柱，將丹參提取液溶于25%、35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%的乙醇后上樣?？疾觳煌絼Υ罂讟渲叫Ч挠绊憽?/p>

將5份預處理好的樹脂用濕法裝柱，蒸餾水充分平衡，然后將濃度分別為2、4、6、8、10mg/mL的丹參提取液以2BV/h的流速上樣吸附，每0.5BV的流出液收集1份，測定流出液的丹參酮濃度，繪制泄漏曲線，根據(jù)曲線確定上樣濃度。

（2）解析液的選擇

將粗提物溶于55%乙醇后上樣。分別用60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%的乙醇進行洗脫，通過薄層色譜檢測洗脫液中含有的成分[展開劑為石油醚(60～90℃):丙酮=4:1]，HPLC檢測各濃度洗脫液中丹參酮的純度，確定合適的洗脫劑。

（3）上樣流速對解吸效果的影響

將5份預處理好的樹脂濕法裝柱(30mL)，將50mL提取液經(jīng)大孔樹脂完全吸附后，用150mL，50%的乙醇分別以1、2.3、4、5BV/h的流速上樣吸附，計算解析率。考察上樣流速對解吸效果的影響。

5、丹參酮純度的檢測

丹參提取液溶于70%乙醇經(jīng)過D101大孔樹脂優(yōu)化后，得到含有丹參酮的洗脫液。洗脫液通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮脫醇，得到丹參酮粗提液。

高效液相色譜條件：AgilentTC-C18色譜柱(4.6mmx250mm，5μm)，流動相乙腈-水，等梯度洗脫；流速：1.0mL/min；測定波長：250nm；柱溫：35℃，進樣量10u。

6、抗疲勞試驗

（1）動物給藥及分組

將100只雄性昆明小鼠(體重20～24g)隨機分成五組，每組20只。按照中國藥典和《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)，小鼠按照空白組、陽性對照組、丹參酮低劑量組、中劑量組、高劑量組隨機分為5組，空白對照組小鼠給予蒸餾水灌胃，陽性對照組給予洋參沖劑250mg/kg。給予丹參酮低劑量(200mg/kg)中劑量(400mg/kg).高劑量(1g/kg)。

（2）負重游泳實驗

小鼠按照各劑量組分組，每組20只，按照連續(xù)灌胃給藥20d，于末次灌胃1h后，在其尾巴根部纏繞自身質(zhì)量5%的鉛塊，負重后置于水溫為25(±1)℃，水深30cm的塑料箱中，觀察其負重游泳情況，紀錄小鼠從開始游泳到死亡的時間，即小鼠的負重游泳時間。

7、抗疲勞指標測定

根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》(2003版)的要求和相關文獻進行實驗。將小鼠按照各劑量組分組，每組20只，連續(xù)灌胃給藥20d，末次灌胃30min后，置于水溫25(+1)℃、水深30cm的塑料箱中不負重游泳90min后取出擦干。摘取眼球采血，采用試劑盒法測定血清中尿素氮和乳酸的含量，接著處死小鼠，取出肝臟，用試劑盒測定肝糖原含量。

8、數(shù)據(jù)處理方法

用Excel建立實驗數(shù)據(jù)庫，組間比較單因素方差分析。

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