L-賴氨酸是人類和動物所必需八大氨基酸之一。在醫(yī)療方面應(yīng)用非常廣泛，比如防治骨質(zhì)疏松癥，提高機體的免疫功能和對傳染病的抗病能力，又如賴谷復(fù)合鹽用于治療慢性腦組織缺血、顱腦外傷病及缺氧性疾病的腦保護，還可以用于治療單純皰疹病毒和帶狀皰疹引起的唇皰疹等。近年來，90%以上的L-賴氨酸產(chǎn)品用于飼料添加劑，各大生產(chǎn)企業(yè)相繼擴能投產(chǎn)，行業(yè)競爭慘烈。如何提高賴氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率、降低設(shè)備腐蝕，是降低生產(chǎn)成本提高企業(yè)競爭力的關(guān)鍵點。

甜菜堿作為發(fā)酵促進劑在氨基酸發(fā)酵中應(yīng)用的研究很多，總結(jié)其主要功能包括兩點：1)維持和調(diào)節(jié)細胞滲透壓。當外界滲透壓發(fā)生劇烈變化時，細胞吸收或合成的甜菜堿通過穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、提高鉀鈉泵功能和阻止胞內(nèi)水分丟失等方式增加細胞對滲透壓的抗性。黃登高等在研究乳酸發(fā)酵時發(fā)現(xiàn)，甜菜堿能夠提高高糖濃度下乳酸菌的細胞生長速率和乳酸脫氫酶的活力，進而提高乳酸產(chǎn)量。2)參與甲基化反應(yīng)。常立群等發(fā)現(xiàn)在谷氨酸發(fā)酵中添加適量甜菜堿可提高谷氨酸產(chǎn)酸。劉麗君在L-異亮氨酸產(chǎn)生菌的選育及發(fā)酵條件研究中介紹到，通過添加甜菜堿2.5g/L使得蘇氨酸發(fā)酵周期縮短12h，L-異亮氨酸產(chǎn)量提高66.3%。趙琳琳在脫氮假單胞菌產(chǎn)VB12發(fā)酵過程中甜菜堿作用機理及其補料策略的研究中介紹了甜菜堿在發(fā)酵過程中作用機理，甲基參與合成甲硫氨酸、VB12和丙氨酸等多種物質(zhì)，并指出甜菜堿分子中含有3個甲基，是高效的甲基供體，還得出甜菜堿質(zhì)量濃度在2～3g/L時菌濃增加了10.5%，VB12產(chǎn)量增加了23.8%的結(jié)論。

磷酸甜菜堿是甜菜堿的磷酸鹽，在賴氨酸發(fā)酵中應(yīng)用研究較少。目前，大多數(shù)企業(yè)在賴氨酸發(fā)酵配方中添加一定量的氯化膽堿起到調(diào)節(jié)滲透壓、提供甲基化反應(yīng)的甲基的作用，但氯化膽堿中氯離子對設(shè)備腐蝕性嚴重。“中國飼料行業(yè)信息網(wǎng)”報道，市場上質(zhì)量分數(shù)為21%的氯化膽堿價格逐年上漲，2016年均價5400元/噸，2017年漲至6319.5元/噸，2018年漲至15000元/噸，已經(jīng)造成賴氨酸發(fā)酵成本上升10元/噸理論酸，而磷酸甜菜堿市場價格2016年為9600元/噸、2017年8952元/噸、2018年13500元/噸。相比之下磷酸甜菜堿價格上漲幅度較小。因此，筆者繼續(xù)實驗了磷酸甜菜堿替代氯化膽堿在賴氨酸發(fā)酵中的應(yīng)用，可為提高賴氨酸發(fā)酵指標、降低生產(chǎn)成本提供方向。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

伊品生物科技股份有限公司菌種中心提供賴氨酸生產(chǎn)用菌。

1.1.2實驗配方

三級種子基礎(chǔ)配方：MnSO₄質(zhì)量2kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量2kg，KH₂PO₄質(zhì)量60kg，K₂HPO₄質(zhì)量60kg，(NH4)₂SO₄質(zhì)量250kg，MgSO₄質(zhì)量30kg，玉米漿體積2.0m3，消泡油質(zhì)量6kg，銅鋅質(zhì)量適量，定容體積35m³。

發(fā)酵底料基礎(chǔ)配方：MnSO4質(zhì)量25kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量25kg，KH₂PO₄質(zhì)量160kg，K₂HPO₄質(zhì)量160kg，H₃PO₄質(zhì)量100kg，(NH4)₂SO₄質(zhì)量800kg，MgSO₄質(zhì)量250kg，玉米漿體積5.0m3，消泡油質(zhì)量200kg，銅鋅質(zhì)量適量，定容體積240m³。

總氮基礎(chǔ)配方：MnSO₄質(zhì)量20kg，F(xiàn)eSO₄質(zhì)量20kg，KH₂PO₄質(zhì)量250kg，K₂HPO₄質(zhì)量250kg，MgSO₄質(zhì)量500kg，消泡油質(zhì)量100kg，定容體積30m³。

1.1.3實驗設(shè)備

體積為2500L的二級種子培養(yǎng)罐，5000L的三級種子培養(yǎng)罐，47000L的發(fā)酵罐，20000L配料罐，三級種子連消系統(tǒng)，底料連消系統(tǒng)，濃糖連消系統(tǒng)，硫銨連消系統(tǒng)，濃糖流加罐，硫銨流加罐，720型紫外分光光度計，100mL容量瓶，0～1000mL移液槍，1mL移液管，吸耳球，洗瓶等。

1.2實驗設(shè)計

在現(xiàn)有三級種子基礎(chǔ)配方上分別用質(zhì)量濃度0.3，0.5，0.7，0.9g/L的磷酸甜菜堿替代氯化膽堿，定容30m³，接種量體積為1500L，OD為0.5的二級種子液，培養(yǎng)溫度30℃，PH實測6.95，溶氧控制>30%，初糖流加量均不變，在成熟凈OD均為0.45的情況下對比成熟周期，確定成熟周期最短時磷酸甜菜堿的用量即為最佳用量。

在現(xiàn)有發(fā)酵底料基礎(chǔ)配方、定容體積、接種量、培養(yǎng)溫度(37℃)、PH實測7.0、溶氧控制>30%、初糖質(zhì)量濃度0.02g/L、發(fā)酵過程殘?zhí)琴|(zhì)量濃度控制6.0g/L、NH⁺₄質(zhì)量濃度控制2.0～4.0g/L，其他因素均不變的情況下，設(shè)計用磷酸甜菜堿替代氯化膽堿的單因素多水平實驗，添加質(zhì)量濃度分別為0.3，0.5，0.7，0.9g/L。對比因變量OD峰值、峰值周期、產(chǎn)酸質(zhì)量濃度、轉(zhuǎn)化率，最終確定磷酸甜菜堿在賴氨酸發(fā)酵底料中最佳用量。

在現(xiàn)有總氮配方基礎(chǔ)上添加磷酸甜菜堿，設(shè)計起始流加時間、總氮中磷酸甜菜堿添加濃度、糖氮比(濃糖與總氮的流加體積比)的三因素多水平正交實驗，對比轉(zhuǎn)化率得出最佳添加質(zhì)量濃度、流加起始時間和糖氮體積比。

1.3分析測定方法

1.3.1OD值檢測方法

取1mL發(fā)酵液，用100mL容量瓶稀釋100倍，使用720型分光光度計在600nm波長下檢測OD值。

1.3.2發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度的測定

賴氨酸質(zhì)量濃度采用茚三酮顯色法測定。

步驟1用賴氨酸標樣配置質(zhì)量濃度為10g/L賴氨酸鹽酸鹽標液，分別取2，3，4，5，6mL賴氨酸鹽酸鹽標液至100mL容量瓶中，用去離子水定容至100mL，得到質(zhì)量濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的賴氨酸鹽酸鹽標樣。

步驟2發(fā)酵液稀釋150～500倍數(shù)，用離心機3500r/min離心10min，得到樣品上清液。

步驟3用1支10mL試管，取pH1.3的茚三酮溶液1mL，加入樣品離心上清液1mL，再用5支10mL試管，各取PH1.3的茚三酮溶液1mL，分別加入質(zhì)量濃度為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6g/L的賴氨酸鹽酸鹽標樣1mL，搖勻后在沸水浴中加熱10min，取出冷卻至室溫，在以上6支試管中繼續(xù)各加8mL去離子水，搖勻后用720型分光光度計在475nm波長下檢測吸光值。

步驟4在Excel中以賴氨酸鹽酸鹽標樣質(zhì)量濃度為縱坐標，吸光值為橫坐標繪制標準曲線，得出標準曲線公式，再將樣品吸光值代入標準曲線公式中計算出發(fā)酵液中賴氨酸質(zhì)量濃度。賴氨酸發(fā)酵糖酸轉(zhuǎn)化率計算公式為

糖酸轉(zhuǎn)化率=(產(chǎn)量/加糖量)×100%

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

1)采用SAS隨機區(qū)組分析法分析磷酸甜菜堿對三級種子活力影響。

2)采用SPSS軟件設(shè)計影響磷酸甜菜堿流加因素的正交實驗，并對實驗結(jié)果做方差分析，確定最佳流加條件。

統(tǒng)計方法分析結(jié)果中的F表示自變量對因變量的影響大?。籶表示自變量對因變量影響大小的顯著度，當p>0.05時表示影響不顯著或無統(tǒng)計學(xué)意義，當0.01<p<0.05時表示影響顯著，當p<0.01時表示影響極其顯著。

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