2.2 HPLC法檢測(cè)PQQ

本實(shí)驗(yàn)首先研究了其他色譜柱檢測(cè)PQQ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)普通C18柱無法使PQQ有效保留，更換流動(dòng)相甲醇和乙腈，或者是梯度洗脫都不能保留PQQ。另外發(fā)現(xiàn)改變pH可以使PQQ有所保留，但峰形較差，且拖尾嚴(yán)重，并且不能很好分離樣品發(fā)酵液中的PQQ。考慮到PQQ極性較大，因此采用耐100%水的COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱來使PQQ有很好的保留。將準(zhǔn)備好的7個(gè)不同濃度的PQQ標(biāo)準(zhǔn)品（100，50，25，12.5，6.125，5，2.5 mg/L）進(jìn)行HPLC檢測(cè)，每個(gè)濃度連續(xù)進(jìn)樣3次，每次進(jìn)樣20 μ L。結(jié)果如圖1所示。不同濃度的PQQ均在3.56 min左右出峰。隨著PQQ濃度的增加，峰面積也逐漸增加。因此PQQ濃度與峰面積呈正相關(guān)的關(guān)系。以PQQ濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系為y=30.27x+7.32，R2=0.9998，說明線性關(guān)系良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色譜柱檢測(cè)PQQ，運(yùn)行時(shí)間短，PQQ出峰時(shí)間早，檢測(cè)效率高。本實(shí)驗(yàn)建立的HPLC法檢測(cè)PQQ具有良好的可行性，可作為菌種產(chǎn)PQQ的復(fù)篩方法。

2.3菌株的篩選和鑒定

經(jīng)光譜法初篩，從100多個(gè)樣品中篩選到50多株P(guān)QQ產(chǎn)生菌，大多數(shù)的產(chǎn)量在2~5 mg/L，少數(shù)可以達(dá)到10 mg/L左右，HPLC復(fù)篩后其中PQQ產(chǎn)量最高的1株為20.6 mg/L，峰圖如圖2所示，PQQ在3.57 min出峰，這是未經(jīng)優(yōu)化已報(bào)道的搖瓶較高產(chǎn)量。

該菌株的菌落在甲醇培養(yǎng)基平板上為乳白色，粘稠的，邊緣整齊，直徑較小，為1~2 mm。菌體細(xì)胞為球狀，革蘭氏陰性，不產(chǎn)芽孢，有莢膜，無鞭毛。該菌株在以甲醇和甲胺為碳源的培養(yǎng)基中能夠良好生長(zhǎng)，能利用D-葡萄糖，蔗糖，果糖和木糖。在以銨鹽、硝酸鹽、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏為氮源的培養(yǎng)基中能良好生長(zhǎng)。采用PCR技術(shù)擴(kuò)增該菌株的16s rDNA 基因序列，經(jīng)上海生工測(cè)序。通過在 NCBI網(wǎng)站中進(jìn)行同源性序列搜索及比對(duì)，從中選取同源性較高菌株的16s rDNA基因序列，以集團(tuán)外菌種作對(duì)照，通過MEGA軟件，用鄰接法（Neighbor-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果如圖3所示，該菌株與 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的同源性最高，為99%。綜合菌落及菌體形態(tài)特征、16s rDNA序列分析，鑒定該菌株為Methylopila sp.菌株，命名為Methylopila sp.Z1。

2.4 甲醇含量的優(yōu)化

研究甲醇的不同添加濃度（0.5%，1%，1.5%，2%，2.5%，3%，3.5%，4%）對(duì)OD600和PQQ產(chǎn)量的影響，結(jié)果如圖4所示。在0.5%~2.5%的濃度范圍內(nèi)，隨著甲醇體積濃度的提高，菌體OD600和PQQ產(chǎn)量也逐漸提高，當(dāng)甲醇濃度為2.5%時(shí)，OD600和PQQ產(chǎn)量均達(dá)到最高，繼續(xù)增加甲醇濃度，OD600和PQQ產(chǎn)量均有明顯下降。這是因?yàn)榧状甲鳛榧?xì)菌生長(zhǎng)的唯一碳源，并且還是細(xì)菌細(xì)胞甲醇脫氫酶的底物，在其濃度較低時(shí)，不足以提供能量使細(xì)胞生長(zhǎng)，也無法生產(chǎn)過量的PQQ排泄到培養(yǎng)基中，導(dǎo)致PQQ合成效率非常低。當(dāng)甲醇濃度逐漸提高時(shí)，細(xì)胞所能利用的碳源增加，菌體OD600和PQQ產(chǎn)量也逐漸增加；當(dāng)甲醇濃度超過2.5%時(shí)，由于甲醇的毒性使細(xì)胞損傷，并且底物濃度過高抑制甲醇脫氫酶的活性，導(dǎo)致菌體OD600和PQQ產(chǎn)量下降。因此，2.5%的甲醇體積濃度對(duì)于菌體生長(zhǎng)和PQQ合成是最佳選擇。

3 結(jié)論

目前PQQ的檢測(cè)方法主要有重組酶法，氧化還原法，光譜法和HPLC，其中重組酶法所用到的葡萄糖脫氫酶提取繁瑣，純化過程復(fù)雜，且得到的酶活不高，不足以支持大量的菌種篩選；氧化還原法中用到的顯色劑氯化硝基四氮唑藍(lán)（NBT）易受培養(yǎng)基中其他成分的干擾，造成陰性結(jié)果。光譜法操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速，但也可能受到培養(yǎng)基中具有相似波長(zhǎng)吸光度的影響，但本實(shí)驗(yàn)采用的是甲醇無機(jī)培養(yǎng)基，并通過HPLC檢測(cè)樣品發(fā)現(xiàn)，基本沒有干擾，因此光譜法作為PQQ產(chǎn)生菌的初篩是高效可行的。本實(shí)驗(yàn)還建立了新的HPLC法檢測(cè)PQQ，采用親水色譜柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ，使得PQQ有很好的保留，并且樣品運(yùn)行時(shí)間短，PQQ在3.56 min出峰，出峰時(shí)間早，檢測(cè)時(shí)間短，峰形無拖尾，為PQQ檢測(cè)提供一種新的改進(jìn)方法。

由于PQQ的生物合成機(jī)理沒有得到完全闡釋，通過基因工程和代謝改造提高PQQ的產(chǎn)量遠(yuǎn)低于野生菌的產(chǎn)量，因此從環(huán)境中篩選具有高產(chǎn)PQQ能力的菌種是十分必要的。本實(shí)驗(yàn)從樣品中篩選到一株P(guān)QQ高產(chǎn)菌，經(jīng)鑒定為Methylopila sp.屬，命名為Methylopila_sp. Z1，未經(jīng)優(yōu)化的搖瓶產(chǎn)量達(dá)到20.6 mg/L，屬于已報(bào)道的較高水平。Z1菌株耐受較高甲醇，在培養(yǎng)基甲醇濃度為2.5%時(shí)，PQQ產(chǎn)量達(dá)26.7 mg/L，相比于初始濃度提高了28%。Z1是一株有高產(chǎn)PQQ潛力的菌株，后續(xù)發(fā)酵罐培養(yǎng)和優(yōu)化工藝將進(jìn)一步提高PQQ產(chǎn)量。

聲明：本文所用圖片、文字來源《食品與發(fā)酵工業(yè)》，版權(quán)歸原作者所有。如涉及作品內(nèi)容、版權(quán)等問題，請(qǐng)與本網(wǎng)聯(lián)系刪除

相關(guān)鏈接：硝酸鹽，蛋白胨，葡萄糖