2.8 10批樣品含量測(cè)定

分別取10批樣品(批號(hào)：20160324、20160616、20160623、20160625、20160704、20160705、20160712、20160714、20160717、20160721、20160724)按供試液法每批次各平行制備2份供試液，按色譜條件自動(dòng)進(jìn)樣測(cè)定，其對(duì)照液白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ(濃度71.76 μg/mL)分別進(jìn)樣30、20、10 μL，且每個(gè)進(jìn)樣量分別進(jìn)樣2次；每份供試液各進(jìn)樣2針，記錄色譜圖和峰面積，并計(jì)算含量以及RSD值(表7)，計(jì)算得馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ不同進(jìn)樣量含量分別為2.15、2.58、2.54，平均含量為2.43 μg/mL，相對(duì)含量RSD=9.82%?？紤]到大規(guī)模生產(chǎn)中的各種損失和測(cè)量誤差，取其平均值的80%作為其含量限度，即2.43×0.80=1.94，故暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)不少于1.94 μg/mL。

3 討論

3.1 待測(cè)組分選擇

白術(shù)的內(nèi)酯類成分具有抗炎、增強(qiáng)免疫、利尿等作用，而且還可以調(diào)理胃腸道和促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅲ的藥理作用較為明顯，也是發(fā)揮白術(shù)健脾益氣、燥濕利水的功效之一。在炮制過(guò)程中蒼術(shù)酮被氧化，其產(chǎn)物是雙白術(shù)內(nèi)酯、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，同時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ在經(jīng)高溫加熱過(guò)程中會(huì)生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ；從氧化反應(yīng)機(jī)制來(lái)看，蒼術(shù)酮易與水發(fā)生加成反應(yīng)，生成半縮醛羥基，而水又導(dǎo)致半縮醛羥基開環(huán)生成羰基，羰基進(jìn)一步被氧化生成羧基，雜化軌道平面兩側(cè)容易被羥基進(jìn)攻羧基，羥基并與羧基進(jìn)行分子內(nèi)脫水反應(yīng)，可生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ和表白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ，而白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ在7位上與碳相連的氫相比較為活躍，易被羥基取代而生成白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ。白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的結(jié)構(gòu)較其穩(wěn)定，更有利于含量測(cè)定。

3.2 供試液前處理

按照萃取溶劑的方法，考察了正丁醇、石油醚(30℃～60℃)、石油醚(60℃～90℃)、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑，經(jīng)過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品色譜法相比較，石油醚(60℃～90℃)所萃取得到的供試液峰形較好，分離度高，但其前面有一小雜峰，后改用甲醇、500 mL/L甲醇水溶液、乙醇、750 mL/L乙醇等作為復(fù)級(jí)溶液，考慮到白術(shù)內(nèi)酯類成分的穩(wěn)定性，并同時(shí)選擇了考察柱溫的最佳條件(20℃、30℃、35℃)，結(jié)果表明，在柱溫為25℃、選用500 mL/L甲醇水溶液作為復(fù)級(jí)溶液，所出的峰形分離度高，峰形對(duì)稱且含量較高。有關(guān)提取次數(shù)優(yōu)選，在其他相同條件下，用石油醚(60℃～90℃)振搖提取3～5次，結(jié)果表明，用供試品提取3次與4、5次有較大差異，而4、5次時(shí)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量無(wú)明顯差異，故選擇用石油醚(60℃～90℃)振搖提取4次。

3.3 色譜條件選擇

本制劑通過(guò)單因素試驗(yàn)，對(duì)其柱子型號(hào)、柱溫、流速、流動(dòng)相比例進(jìn)行優(yōu)化和系統(tǒng)適用性試驗(yàn)以及波長(zhǎng)的選擇，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的最大吸收波長(zhǎng)，結(jié)果在223 nm處吸收峰最強(qiáng)；在流動(dòng)相選擇上參考其他學(xué)者研究，用標(biāo)準(zhǔn)品白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ進(jìn)行判定等度條件下使用甲醇-水(60∶40)、乙腈-水(60∶40)的出峰情況，試驗(yàn)表明用甲醇-水(60∶40)對(duì)其標(biāo)準(zhǔn)品的峰更好，含量更高，同樣條件下進(jìn)樣測(cè)定供試液，發(fā)現(xiàn)其分離度達(dá)不到《中國(guó)獸藥典》的要求，雜峰較多，故進(jìn)行了梯度洗脫，考慮中藥成分復(fù)雜多樣，會(huì)影響色譜柱的質(zhì)量以及下一針進(jìn)樣的出峰情況，故在樣品目標(biāo)峰等完全出完過(guò)后使用了純甲醇進(jìn)行沖洗色譜柱10 min， 然后用15 min再平衡到流動(dòng)相的初始比例以方便下一針進(jìn)樣分析，最終確定了流動(dòng)相條件。在其他條件不變情況下，柱溫的改變對(duì)其供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.15%，且柱溫過(guò)高，易導(dǎo)致峰形不對(duì)稱，有拖尾現(xiàn)象，綜合考慮，最終選用柱溫為25℃；在柱溫25℃等其他條件不變情況下，改變流速0.8 mL/min±0.2 mL/min， 發(fā)現(xiàn)供試品溶液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.49%，說(shuō)明改變流速對(duì)樣品中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測(cè)定無(wú)影響，對(duì)其樣品出峰時(shí)間早晚有一定影響，但對(duì)峰的對(duì)稱性、分離度無(wú)影響，故最終確定流速為0.8 mL/min。

試驗(yàn)證明以流動(dòng)相甲醇-水(體積比)進(jìn)行梯度洗脫(甲醇60→65、水40→35運(yùn)行30 min， 甲醇65→100、水35→0運(yùn)行2 min， 甲醇100、水0運(yùn)行10 min， 甲醇100→60、水0→4運(yùn)行3 min， 甲醇60、水40運(yùn)行15 min)、檢測(cè)波長(zhǎng)223 nm、柱溫25℃、流速0.8 mL/min的色譜條件對(duì)白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的測(cè)定具有較強(qiáng)的專屬性，能達(dá)到基線平衡、與其他組分離度較高、峰形對(duì)稱、陰性對(duì)照無(wú)干擾、大大縮短分析時(shí)間，便于作為含量測(cè)定和方法學(xué)研究。

建立的HPLC方法測(cè)定白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ含量的線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)的平均峰面積RSD分別為2.00%、6.00%和8.58%；平均加樣回收率為98.04%，RSD=11.89%，其回收率相對(duì)良好，進(jìn)行10批樣品的含量測(cè)定，暫定馬香苓口服液中白術(shù)藥材按白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ計(jì)不少于1.94 μg/mL。表明所建立的HPLC特征圖譜專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確可行、簡(jiǎn)便，可快速用于鑒別馬香苓口服液中白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ以及其含量，可有效地用于該制劑的質(zhì)量控制，同時(shí)該方法還可以為進(jìn)一步加強(qiáng)含白術(shù)類化合物的制劑質(zhì)量控制提供參考，為申報(bào)新獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

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