為滿足快速高效評價微生物培養(yǎng)基生長率的需求，提出一種新的微生物標準物質(zhì)研制思路，并研制出具有2種特性量值的大腸桿菌標準物質(zhì)。研制過程中同時使用平板計數(shù)瓊脂（plate count agar,PCA）培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar,VRBA）培養(yǎng)基進行均勻性評估、穩(wěn)定性評估、6家實驗室合作定值以及不確定度評定。實驗結(jié)果表明：大腸桿菌標準物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性良好，可以在–20℃下穩(wěn)定保存6個月。該標準物質(zhì)基于PCA培養(yǎng)基的標準值為(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA培養(yǎng)基的標準值為(6.1±1.0)×103 CFU/g。使用該標準物質(zhì)對多個PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的生長率進行評價，評價結(jié)果和國標方法有很好的相關(guān)性。綜上所述，研制的大腸桿菌標準物質(zhì)可以用于多種培養(yǎng)基的生長率評價，具有方便快捷的優(yōu)點。

0 引言

食品微生物檢驗是構(gòu)建我國食品安全和生物安全體系的重要支撐和保障。而菌落總數(shù)和大腸菌群指標是食品微生物檢驗中最基本、最常見的檢測項目。國家標準規(guī)定菌落總數(shù)和大腸菌群的檢測分別需要平板計數(shù)瓊脂（plate count agar,PCA）培養(yǎng)基和結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（violet red bile agar,VRBA）培養(yǎng)基，因此這兩種培養(yǎng)基的質(zhì)量直接影響菌落總數(shù)和大腸菌群檢測結(jié)果的準確性。PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的質(zhì)量控制也受到了微生物研究機構(gòu)、檢測機構(gòu)、生產(chǎn)廠家的高度重視。

生長率是培養(yǎng)基質(zhì)量控制的關(guān)鍵指標之一?，F(xiàn)行的生長率評價方法來自國標GB 4789.28—2013《食品安全國家標準食品微生物學檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》。該標準規(guī)定，PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的生長率評價都需要使用大腸桿菌作為質(zhì)控菌株。質(zhì)控菌株經(jīng)過復蘇和培養(yǎng)后，分別接種到待測培養(yǎng)基和參比培養(yǎng)基進行培養(yǎng)計數(shù)，且每個平板的接種水平需要控制在20～200 CFU之間。該方法費事費力，重復性和再現(xiàn)性有待提高。針對現(xiàn)行評價方法的缺陷，本項目組在之前的研究中提出一種基于微生物標準物質(zhì)的生長率評價方法，即用于接種的質(zhì)控菌株以標準物質(zhì)的形式存在。該方法可以顯著減少工作量、有效提高接種數(shù)量的準確性，并將時間縮短至1天以內(nèi)。鑒于此，為了快速高效評價PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的生長率，需要研制量值精確、均勻穩(wěn)定的大腸桿菌標準物質(zhì)。

微生物計數(shù)結(jié)果具有較高的培養(yǎng)基依賴性。以大腸桿菌為例，同一大腸桿菌樣本在不同種類培養(yǎng)基上可能得到差異顯著的計數(shù)結(jié)果。目前我國僅有的3個有證大腸桿菌標準物質(zhì)GBW(E)091094、GBW(E)091095、GBW(E)091096都是基于單種培養(yǎng)基進行定值和使用的。這3個標準物質(zhì)難以滿足PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基生長率評價的需要。

綜上所述，本文選用大腸桿菌標準菌株作為評價菌株，將其制備成標準物質(zhì)。同時使用PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基進行多家實驗室合作定值，并對其均勻性、穩(wěn)定性和不確定度進行評估或評定。研制的大腸桿菌標準物質(zhì)將具有兩種特性量值，可以用于PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基生長率的評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株

大腸桿菌：菌株號ATCC 25922，中國工業(yè)微生物菌種保藏中心。

1.1.2 主要培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基：品牌分別為北京陸橋、廣東環(huán)凱、青島海博、美國BD、英國Oxoid，隨機編號為A1、A2、A3、A4、A5。

VRBA培養(yǎng)基：品牌分別為北京陸橋、廣東環(huán)凱、青島海博、美國BD、英國Oxoid，隨機編號為B1、B2、B3、B4、B5。

1.1.3 儀器

凍干機：Genesis SQ e L-85型，美國SP Scientific公司；電子天平：BS224S型，德國賽多利斯公司；離心機：1-14型，德國賽多利斯公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱：HZQ-X100型，江蘇太倉市實驗設備廠；恒溫培養(yǎng)箱：DNP-9272型，上海精宏實驗設備有限公司；去離子水機：Mill Q型，德國默克公司；高壓滅菌鍋：HG-50型，日本Hirayama公司。

1.1.4 試劑

磷酸鹽緩沖溶液（phosphate buffered solution,PBS,p H 7.2±0.2）、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar,TSA）培養(yǎng)基：北京陸橋技術(shù)有限責任公司；脫脂奶粉：美國BD公司；海藻糖、蔗糖、谷氨酸鈉、麥芽糊、抗壞血酸鈉：分析純，Sigma公司；西林瓶：規(guī)格為8 m L，深圳市寶安區(qū)沙井博海玻璃制品廠。

1.2 大腸桿菌標準物質(zhì)的制備與測定方法

根據(jù)本實驗室先前的制備工藝制備大腸桿菌標準物質(zhì)。將大腸桿菌標準菌株接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃、200 r/min培養(yǎng)12 h。隨后10 000g離心5 min，棄去上清液，菌泥用PBS重懸并稀釋，得到適宜濃度的大腸桿菌菌液。參考先前的配方配制保護劑，加入大腸桿菌菌液后，將保護劑分裝至棕色西林瓶中。分裝完畢，將西林瓶轉(zhuǎn)移至凍干機內(nèi)進行凍干。凍干結(jié)束將樣品壓蓋密封，得到大腸桿菌標準物質(zhì)200個單元，規(guī)格為0.5 g/瓶。

使用PCA培養(yǎng)基或VRBA培養(yǎng)基測定標準物質(zhì)的方法參考GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》或GB4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》第二法。使用天平稱量4.5 g無菌蒸餾水復溶標準物質(zhì)，然后用PBS對樣品勻液進行10倍系列稀釋。選擇3個適宜稀釋度，每個稀釋度分別吸取1 m L樣品懸液接種于無菌平皿，每個稀釋度至少重復3次。接下來使用PCA傾注平板法或VRBA傾注平板法進行大腸桿菌數(shù)量的測定。

1.3 標準物質(zhì)均勻性評估

根據(jù)JJF 1343—2012《標準物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學原理》的要求，按照隨機抽樣原則對標準物質(zhì)的均勻性進行評估。隨機抽取11個單元的標準物質(zhì)，分別使用PCA傾注平板法和VRBA傾注平板法對每個單元標準物質(zhì)的大腸桿菌數(shù)量進行測定，每瓶樣品重復檢測3次。

1.4 標準物質(zhì)穩(wěn)定性評估

穩(wěn)定性考察主要涉及標準物質(zhì)在運輸過程中的穩(wěn)定性、客戶端的貯存條件和使用有效期。首先，對標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性進行評估。檢驗溫度分別為–20℃和4℃，考察時間為7 d（分別為第0,1,3,5,7 d）。每次從–20℃和4℃下分別抽取3個單元的標準物質(zhì)，使用PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基進行大腸桿菌數(shù)量測定。接下來，按照先密后疏的原則，對標準物質(zhì)的長期穩(wěn)定性進行評估。長期穩(wěn)定性檢驗溫度為–20℃，考察時間為6個月（分別為第0,1,2,4,6個月）。每次從–20℃抽取3個單元，使用PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基進行測定。

1.5 標準物質(zhì)的定值

依據(jù)JJF 1343—2012和CNAS-GL29—2010的要求，標準物質(zhì)經(jīng)由6家通過CNAS認可的實驗室合作定值。每家實驗室分別使用PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基測定3個單元的標準物質(zhì)，每個標準物質(zhì)重復測量3次，測量方法參考1.2節(jié)。大腸桿菌標準物質(zhì)的標準值為6家實驗室測量結(jié)果的平均值。

1.6 評價PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的生長率的方法

使用PCA（或VRBA）培養(yǎng)基，對一個單元的大腸桿菌標準物質(zhì)進行3次重復測量，并根據(jù)下式計算大腸桿菌在該培養(yǎng)基上的生長率：

式中：PR——待測PCA（或VRBA）培養(yǎng)基的生長率；

NS-3次使用PCA（或VRBA）培養(yǎng)基測定標準物質(zhì)的平均結(jié)果；

N0——大腸桿菌標準物質(zhì)基于PCA（或VRBA)培養(yǎng)基的標準值。

大腸桿菌標準物質(zhì)基于PCA培養(yǎng)基的標準值為(7.1±1.1)×103 CFU/g，基于VRBA培養(yǎng)基的標準值為(6.1±1.0)×103 CFU/g（見2.4定值結(jié)果的不確定度評定）。因此使用PCA培養(yǎng)基測定大腸桿菌標準物質(zhì)的結(jié)果NS應大于6.0×103 CFU/g，使用VRBA培養(yǎng)基的測定結(jié)果NS應大于5.1×103 CFU/g。即待測PCA培養(yǎng)基的生長率應滿足PR≥0.84的要求；待測VRBA培養(yǎng)基的生長率應滿足PR≥0.83的要求。

1.7 不同品牌培養(yǎng)基生長率的評價

根據(jù)GB 4789.28—2013[9]的規(guī)定，PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的參比培養(yǎng)基均為TSA培養(yǎng)基。使用不同品牌的PCA培養(yǎng)基（A1～A5）和VRBA培養(yǎng)基（B1～B5）、以及參比培養(yǎng)基TSA，分別對3個單元的大腸桿菌標準物質(zhì)進行測定。根據(jù)式（1）計算待測PCA培養(yǎng)基和VRBA培養(yǎng)基的生長率。同時參考國標方法，計算培養(yǎng)基的生長率，待測培養(yǎng)基的生長率為該培養(yǎng)基的測定結(jié)果與TSA的測定結(jié)果的比值。

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