紫甘藍(lán)又名赤甘藍(lán)、紅甘藍(lán)，屬于十字花科，蕓薹屬甘藍(lán)種的一個(gè)變種。十字花科植物當(dāng)中含有較為豐富的多酚類(lèi)物質(zhì)，紫甘藍(lán)中的多酚類(lèi)化合物主要是花青素，花青素在植物體內(nèi)主要以糖苷的形式存在，紫甘藍(lán)中的花色苷類(lèi)化合物主要為矢車(chē)菊色素的糖苷?；ㄇ嗨鼐哂锌寡趸?、抗癌和降血糖等生理活性，同時(shí)紫甘藍(lán)花青素在酸性到中性范圍內(nèi)可以實(shí)現(xiàn)顏色由紅到紫的轉(zhuǎn)變，可以廣泛應(yīng)用于糖果、飲料等食品生產(chǎn)當(dāng)中，因此將紫甘藍(lán)花青素開(kāi)發(fā)成為食品添加劑具有很高的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。

雙水相萃取是一種新型的物質(zhì)分離技術(shù)，與傳統(tǒng)分離方法相比，具有條件溫和、產(chǎn)品活性損失小、分離步驟少、無(wú)有機(jī)溶劑殘留、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化和抗生素的提取，近些年來(lái)逐漸應(yīng)用于天然色素的分離純化研究，國(guó)內(nèi)對(duì)于使用雙水相萃取純化紫甘藍(lán)色素的研究相對(duì)較少，國(guó)外有相關(guān)的報(bào)道，但并未對(duì)其萃取條件進(jìn)行優(yōu)化。

紫甘藍(lán)色素生產(chǎn)時(shí)，粗提液中含有大量的糖類(lèi)雜質(zhì)，極大地影響了色素的品質(zhì)和穩(wěn)定性。傳統(tǒng)工業(yè)對(duì)于植物花青素的提取主要采用酸水浸提法、溶劑法，還有超聲波法?；ㄉ杖芤褐泻写罅康膯翁?、二元糖、低聚糖和多糖等雜質(zhì)。目前，柱色譜、高速逆流色譜和大孔吸附樹(shù)脂廣泛應(yīng)用于花青素的分離、純化，可以實(shí)現(xiàn)色素與其糖類(lèi)物質(zhì)的分離，但與雙水相萃取相比，成本較高、時(shí)間較長(zhǎng)、對(duì)操作要求嚴(yán)格。因此使用雙水相萃取的方法實(shí)現(xiàn)植物花青素與其糖類(lèi)雜質(zhì)的分離屬于一種新型、快速、低成本的操作方式。本研究嘗試使用雙水相萃取技術(shù)，將紫甘藍(lán)色素與糖類(lèi)物質(zhì)分離，通過(guò)選擇性系數(shù)表征此方法的有效性。

一、材料和方法

1、實(shí)驗(yàn)儀器

pH211酸度計(jì)；TDL-60B低速大容量離心機(jī)；HY-6雙層振蕩器；752S紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；AR1530分析天平。

2、實(shí)驗(yàn)材料

紫甘藍(lán)；PEG6000配制成400g／L；苯酚為優(yōu)級(jí)純；其他試劑均為分析純。

3、分析方法

（1）紫甘藍(lán)色素屬于花色苷類(lèi)，按照美國(guó)化學(xué)工程師協(xié)會(huì)（AOAC）對(duì)花青素類(lèi)天然色素中花色苷總量的方法進(jìn)行測(cè)定，以矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷計(jì)。

式中：

吸光度A=（A₅₂₀-A₇₀₀）_pH1.0-（A₅₂₀-A₇₀₀）_pH4.5

M：矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量，449.2g／mol；

D：樣品儲(chǔ)備液的稀釋倍數(shù)；

1：光路長(zhǎng)，cm，測(cè)試中采用1cm光路長(zhǎng)的比色皿；

ε：26900，矢車(chē)菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)，L·mol^-1·cm^-1；

1000：由g換算成mg的轉(zhuǎn)換系數(shù)。

（2）使用苯酚-硫酸法對(duì)上下相中總糖含量進(jìn)行測(cè)定。

（3）選擇性系數(shù)k的計(jì)算。

式中：

K_花：花青素的分配系數(shù)；

K_糖：多糖的分配系數(shù)；

C_上花：上相中花青素的質(zhì)量濃度，mg／L；

C_下花：下相中花青素的質(zhì)量濃度，mg／L；

C_上糖：上相中糖類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg／mL；

C_下糖：下相中糖類(lèi)物質(zhì)的質(zhì)量濃度，mg／mL。

4、試驗(yàn)方法

（1）紫甘藍(lán)色素粗提液制備

取適量紫甘藍(lán)洗凈、切碎，使用榨汁機(jī)榨取原汁，100目濾布過(guò)濾，3000r／min離心15min，取上層清夜冷藏保存，使用前調(diào)pH。

（2）雙水相體系建立

固定體系質(zhì)量為30.0g。在50mL離心管中分別加入一定質(zhì)量的硫酸銨和PEG6000原液，加入一定質(zhì)量預(yù)先調(diào)過(guò)pH的色素粗提液，加水補(bǔ)至體系質(zhì)量為30.0g，置于振蕩器上300r／min于室溫下震蕩10min后取下，讀取上下相體積，用移液管分別移取上下相溶液于30mL比色管中。

（3）花色苷含量的測(cè)定

精密吸取上下相溶液，分別用pH=1.0的氯化鉀緩沖溶液和pH=4.5醋酸鈉緩沖溶液稀釋適當(dāng)倍數(shù)，以蒸餾水做空白，分別在520nm和700nm下測(cè)吸光值。計(jì)算上下相中花色苷含量，而計(jì)算出K_花。在700nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度值是為了校正混濁對(duì)測(cè)定結(jié)果的干擾。

（4）多糖含量的測(cè)定

以葡萄糖為對(duì)照，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的含量。回歸方程為：y=8.1114x-0.0069，R²=0.9983。分別精密吸取上下相樣品稀釋液1.0mL于試管中，加入5%的苯酚溶液1.0mL，迅速加入濃硫酸溶液5.0mL，搖勻，放置10min后于40℃水浴加熱10min，取出后冷水浴5min，以相應(yīng)試劑為空白，在490nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算得到K_糖。

（5）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

由于各因素（即硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)、PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、體系pH、粗提液質(zhì)量分?jǐn)?shù)）之間有相互協(xié)同作用，如表1所示，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)并分析，圖1中硫酸銨的濃度在最高值18%時(shí)，選擇性系數(shù)最大，因此正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)硫酸銨濃度繼續(xù)增高，為18%、19%、20%三個(gè)水平。

二、結(jié)果與討論

1、單因素實(shí)驗(yàn)

（1）硫酸銨的質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)選擇性系數(shù)k的影響在50mL離心管中加入15.0gPEG6000原液，4.2g色素粗提液，分別加入3.0g、3.6g、4.2g、4.8g、5.4g硫酸銨，調(diào)節(jié)體系pH為5，雙水相萃取結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，選擇性系數(shù)k呈上升趨勢(shì)，選擇性系數(shù)在硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18%時(shí)達(dá)到最高。隨著硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，增強(qiáng)了上下兩相物質(zhì)的分相，提高了上相中花青素的濃度，同時(shí)提高了糖類(lèi)雜質(zhì)在下相的含量，增加了對(duì)色素的純化程度。

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