目的

采用HPLC波長切換法同時測定喘舒片中鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量。

方法

采用AgilentTC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，檢測波長分別為245、278、254nm，流速1.0mL·min-1，柱溫35℃。結果鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的線性范圍分別為0.92～18.28（r=0.9989）、63.75～1275（r=0.9999）、11.07～221.4（r=0.9996）、6.07～121.40（r=0.9995）、1.20～24.10（r=0.9998）、1.20～24.08（r=0.9994）、2.08～24.16（r=0.9999）、2.89～57.88（r=0.9993）、1.79～35.80（r=0.9997）μg·mL-1；平均加樣回收率分別為98.62%、100.02%、99.84%、97.35%、98.38%、98.92%、100.23%、99.84%、97.74%，RSD分別為1.28%、1.61%、0.78%、1.02%、2.57%、1.80%、1.53%、1.29%、2.42%；9種成份在樣品中的含量分別為每片8.65×10-3～0.01104、49.460～57.464、0.864～1.883、0.215～0.388、0.0371～0.0866、0.0399～0.131、0.0464～0.0916、0.143～0.327、0.154～0.267mg。

結論

所用方法簡便、準確、重復性好，靈敏度高，可用于喘舒片的質量控制。

喘舒片質量標準收載于衛(wèi)生部藥品標準中藥成方制劑第三冊（標準號：WS3-B-0636-91），是由升華硫、大黃粉、鹽酸克倫特羅和黃芩提取物（以黃芩苷計）組成的中西藥復方制劑，適用于慢性支氣管炎、支氣管哮喘、肺氣腫，尤其是實喘息性氣管炎的治療。方中大黃具抗菌、消炎、止血的作用；升華硫、鹽酸克倫特羅能止咳、化痰、定喘，用于防治支氣管哮喘、慢性喘息性支氣管炎、肺氣腫等疾病所致的支氣管痙攣；黃芩提取物清熱燥濕，尤善清上焦熱邪，具抑菌、抗炎、抗變態(tài)反應、緩解哮喘、解痙攣等作用。諸藥相和，達到清肺熱、化痰定喘的功效。國內(nèi)有河南華峰制藥有限公司和山東百維藥業(yè)有限公司兩家喘舒片生產(chǎn)企業(yè)，前者采用HPLC法分別對鹽酸克侖特羅和黃芩苷進行單組分含量測定，后者采用UV法控制鹽酸克侖特羅的含量。文獻報道中有關喘舒片指標性成分的含量測定多見于單一藥味成分的研究，課題組前期曾采用HPLC法同時測定了喘舒片中5種蒽醌類成分的含量。中西藥復方制劑的療效是由多組分共同作用的結果，單一組分的定量分析難以實現(xiàn)對制劑整體質量控制的目的，為全面有效地控制喘舒片的質量，現(xiàn)采用HPLC波長切換法同時測定喘舒片中鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚等9種成分的含量，為全面評價喘舒片的整體質量提供了依據(jù)。

1實驗部分

1.1儀器與試藥

1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫）。鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等對照品（100072-201503、110715-201619、111595-200503、111514-200403、110795-201007、0757-200206、110756-201512、110796-201520、110758-201013，含量分別為90.5%、93.5%、99.8%、99.8%、98.0%、98.8%、98.7%、99.2%、99.8%）。喘舒片（河南華峰制藥有限公司，批號分別為：20180104、20181101、20190802、20191001、20191101；山東百維藥業(yè)有限公司，批號：20190412）；乙腈為色譜純；磷酸為優(yōu)級純；水為純凈水。

1.2方法與結果

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性的試驗

采用AgilentTC-C18（2）色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為甲醇（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～5min、50%A，5～35min、50%～70%A，35～55min、70%～75%A，55～60min、75%～50%A），流速1.0mL·min-1，柱溫35℃，進樣量10μL，檢測波長分別為245nm（鹽酸克侖特羅）、278nm（黃芩苷、黃芩素）、254nm（蘆薈大黃素、漢黃芩素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚）。

取混合對照品、供試品及各陰性樣品溶液各10μL，在上述色譜條件下分別進樣，記錄色譜圖（圖1）。各待測成分色譜峰均能達到基線分離，分離度大于1.5，各組分吸收峰的理論板數(shù)均不低于3.0×103，陰性樣品溶液圖譜顯示其他成分對9種待測成分無干擾。

1.2.2溶液的制備

精密稱取鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚對照品適量，置同一量瓶中，加甲醇溶解并定容，制得分別含18.28μg·mL-1鹽酸克侖特羅、1.275mg·mL-1黃芩苷、0.2214mg·mL-1黃芩素、121.4μg·mL-1漢黃芩素、24.1μg·mL-1蘆薈大黃素、24.08μg·mL-1大黃酸、24.158μg·mL-1大黃素、57.88μg·mL-1大黃酚、35.80μg·mL-1大黃素甲醚的混合對照品溶液。

取喘舒片供試品適量，除去包衣，研細，取1.0g細粉，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入25mL甲醇，密塞，稱定重量，超聲提取30min，取出，冷卻至室溫，稱重，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按喘舒片的處方和制備方法，分別制備缺鹽酸克侖特羅、缺黃芩提取物、缺大黃粉的陰性樣品，同法分別制成各陰性樣品溶液。

1.2.3線性關系的考察

精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液0.5、1、2、5、8、10mL，分別置10mL量瓶中，加甲醇稀釋并定容，制得系列濃度對照溶液。分別進樣測定，記錄峰面積，以對照品濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程，線性范圍及相關系數(shù)（表1）。

1.2.4精密度、重復性與穩(wěn)定性的試驗

精密吸取“1.2.2”項下混合對照品溶液，連續(xù)進樣6次，計算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.21%、0.74%、0.48%、1.72%、0.89%、1.51%、0.60%、1.43%、1.83%，表明儀器的精密度良好。取喘舒片樣品（批號：20191101），按“1.2.2”項方法平行制備6份供試品溶液，分別進樣測定，計算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚含量的RSD分別為2.23%、1.02%、1.27%、1.74%、2.04%、1.48%、1.82%、2.64%，表明方法的重復性良好。

取同一供試品溶液，在常溫下，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24h后進樣分析，計算得鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.80%、1.49%、1.32%、1.71%、2.33%、1.79%、1.72%、2.03%、2.38%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.5加樣回收率的試驗

精密稱取含量已知的喘舒片樣品（批號：20191101）粉末6份，加入相當于樣品含量100%的對照品溶液，按“1.2.2”項方法制備供試品溶液，分別進樣，記錄峰面積，計算加樣回收率。

鹽酸克侖特羅、黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚和大黃素甲醚的平均加樣回收率分別為99.62%、100.02%、99.84%、97.35%、98.38%、98.92%、100.23%、99.84%、97.74%，RSD分別為1.28%、1.61%、0.78%、1.02%、2.57%、1.80%、1.53%、1.29%、2.42%。

1.2.6樣品的含量測定

取6批喘舒片樣品，分別按“1.2.2”項方法制備供試品溶液，按“1.2.1”項色譜條件測定，采用外標法計算每片樣品中各待測組分的含量（表2）。

2討論

在喘舒片處方中，鹽酸克倫特羅屬微量成分（標示量為每片10μg），黃芩提取物（以黃芩苷計）的理論含量為每片60mg，兩種組分含量的巨大差異讓同時測定兩者的含量比較困難。參考處方中部分待測組分的理論含量，并結合樣品分析圖譜中各待測組分的相對含量，經(jīng)反復實驗摸索，最終文中對照溶液的濃度，在實驗濃度范圍內(nèi)，9種待測組分的含量均在擬合回歸方程的線性范圍內(nèi)。曾考察了不同濃度的甲醇溶液及甲醇-鹽酸（100∶1）作為溶劑的超聲提取效果。

結果表明：以甲醇-鹽酸（100∶1）為提取溶劑時，液相色譜圖譜雜質峰增多，黃芩素色譜峰與相鄰雜質峰無法實現(xiàn)基線分離。黃芩苷色譜峰消失，黃芩苷為一元弱酸化合物，與酸堿作用具有多位反應點，推測可能在酸性環(huán)境中發(fā)生了酸催化的水解反應。以甲醇為提取溶劑，超聲提取30min，提取效果最好，色譜圖雜質峰少，基線穩(wěn)定，9個目標物與相鄰峰均能完全分離，分離度大于1.5。曾考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲醇-磷酸-水、乙腈-磷酸-水等流動相系統(tǒng)，最終選擇文中流動相系統(tǒng)，實現(xiàn)了9種待測成分和相鄰雜質峰的良好分離。

采用HPLC-DAD在190～400nm掃描，結果顯示：鹽酸克侖特羅的最大吸收波長為245nm，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素在220、278、318nm均有較大吸收，大黃粉中蒽醌類成分在254～265nm有較強的紫外吸收。

因此，文中采用245、278、254nm作為測定波長，可實現(xiàn)對供試品溶液中9種目標物的良好分離，滿足方法學考察的要求。

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