糖尿病為一種以高血糖為特征的代謝性疾病，近年來發(fā)病率持續(xù)上升。糖苷酶抑制劑被稱為治療糖尿病的第四類藥物，可以延緩單糖吸收，降低餐后高血糖，使胰島素的分泌得到改善。目前葡萄糖苷酶抑制劑的來源主要有3種途徑：化學合成、植物提取、微生物發(fā)酵。植物來源的葡萄糖苷酶抑制劑，具有治療作用溫和持久、副作用小、可長期使用等特點。

目前從植物中提取得到的葡萄糖苷酶抑制劑主要有：黃酮、生物堿、萜類、酚類、多糖等。研究發(fā)現(xiàn)，多種植物多糖有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，但部分天然多糖的活性與已用于臨床的糖苷酶抑制劑有一定的差距?；瘜W修飾是改善活性的有效途徑之一，通過對多糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團進行修飾，可能會增強活性或產(chǎn)生新的活性。
川木瓜為薔薇科木瓜屬植物貼梗海棠的成熟果實。廣西百色市凌云縣有豐富的川木瓜資源，其花可作有較好的觀賞價值，果實即可食用又可藥用，有“百益之果”的美稱。川木瓜作食用，含有氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等；作藥用，有軟化血管、降糖、降壓、提高人體免疫力和護肝降酶等功效。

目前國內(nèi)外對川木瓜的活性的研究主要集中在有機酸、三萜和黃酮類物質(zhì)上，對川木瓜多糖的研究相對較少。課題組研究發(fā)現(xiàn)，川木瓜多糖具有抑制α-葡萄糖苷酶的作用，川木瓜多糖進行羧甲基化修飾可以增強對α-葡萄糖苷酶的抑制作用。不同條件下羧基甲化的產(chǎn)物對α-葡萄糖苷酶的抑制作用有較大的差異。本試驗先優(yōu)化羧甲基化反應(yīng)的工藝條件，再測試不同取代度的羧甲基多糖抑酶活性，旨在得到具有較好抑酶活性的羧甲基化川木瓜多糖。

一、材料與方法

1、材料、試劑與儀器

材料：川木瓜購于廣西百色市凌云縣，切片、晾干、粉碎過篩備用。

試劑：木瓜蛋白酶；4-硝基酚-2-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）；α-葡萄糖苷酶；阿卡波糖；乙醇、氯乙酸、異丙醇、氫氧化鈉等其余試劑均為分析純。

分析純。儀器：E-201-C型pH復(fù)合電極；CPA64型電子天平；UV-1750紫外可見分光光度計；640一IR傅利葉變換紅外光譜儀；SMARllAB3Kwx-衍射儀；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；HitachiSU8220掃描電鏡；m-lA-50真空冷凍干燥機；HHS-21-4電熱式恒溫水浴鍋。

2、方法

（1）川木瓜多糖的提取及純化工藝流程

川木瓜粉末→石油醚回流脫脂→85％乙醇回流除去色素、低聚糖等小分子→抽濾→烘干濾渣→加入蒸餾水浸提2次→減壓濃縮多糖提取液→乙醇沉淀→離心分離得粗多糖→木瓜蛋白酶脫蛋白→Sevag法脫蛋白→活性炭脫色素→多糖液濃縮→乙醇沉淀→離心分離→冷凍干燥→得精制多糖。

（2）羧甲基川木瓜多糖的制備

①單因素試驗

采用氫氧化鈉-氯乙酸法制備羧甲基川木瓜多糖。稱取0.50g精制川木瓜多糖于三口瓶中，加入50mL異丙醇，在常溫下攪拌20min，緩慢加入一定濃度的NaOH溶液10mL，繼續(xù)攪拌40min，將一定質(zhì)量氯乙酸加入反應(yīng)體系中，升溫至一定溫度水浴反應(yīng)一段時間，反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，用稀鹽酸調(diào)pH至中性，裝人透析袋中，用蒸餾水透析48h，減壓濃縮多糖溶液，用3倍90％乙醇沉淀多糖，離心分離，冷凍干燥，得羧甲基川木瓜多糖，取少量樣品測取代度。以NaOH用量、氯乙酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間為單因素，研究各因素對取代度的影響。

②正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取NaOH用量、氯乙酸用量、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間為考察因素，以羧甲基川木瓜多糖的取代度為制備指標，進行L9（34）正交試驗，優(yōu)化羧甲基川木瓜多糖的制備工藝，正交試驗因素水平設(shè)置見表1。

（3）取代度測定

羧甲基川木瓜多糖的取代度參照文獻進行測定。精確稱取0.05g羧甲基川木多糖，溶于標準鹽酸溶液中，置磁力攪拌器中攪拌溶解，用標準氫氧化鈉溶液滴定，分別記下pH為2.1和4.3時消耗的NaOH溶液體積V₁、V₂，取代度按下式計算。

式中：DS為取代度；

m為羧甲基川木多糖的質(zhì)量；

c為標準氫氧化鈉溶液的濃度。

（4）紅外光譜分析

取少量干燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖樣品與溴化鉀粉末混合研磨后壓片，用紅外光譜儀在4000～400cm^-1范圍內(nèi)掃描。

（5）掃描電鏡形貌分析

取少量干燥的川木瓜多糖與羧甲基川木瓜多糖樣品放樣品臺上，置離子濺射儀中鍍導(dǎo)電金膜，在5kV高壓下分別觀察不同放大倍數(shù)下的表面結(jié)構(gòu)。

（6）X衍射分析

取少量干燥的川木瓜多糖、羧甲基川木瓜多糖樣品在X-射線衍射儀上測量X-射線的強度，掃描角度為5～90，掃描速度為7⁰／min。

（7）不同取代度羧甲基川木瓜多糖對α-葡萄糖苷酶的抑制作用

分別選取低、中、高3種取代度的羧甲基川木瓜多糖測定抑制α-葡萄糖營酶的活性，以PNPG為底物，用比色法測試抑制作用。在具塞比色管中試管中加入2mLpH為6.8磷酸鹽緩沖溶液，0.2mL0.1U／mL的。α-葡萄糖苷酶，羧甲基川木瓜多糖溶液lmL，混勻后置37℃水浴15min，再加入20mmol／LPNPG0.3mL啟動反應(yīng)，在37℃繼續(xù)反應(yīng)20min，加入2mL0.1mol／LNa₂C0₃終止反應(yīng)，測定400nm處吸光度值。每個樣品重復(fù)3次，取平均值，按下式計算抑制除率。

抑制率％=[Ao-（A₁—A₂）]／Ao×100

式中：Ao為磷酸緩沖液代替多糖溶液的吸光度；

A₁為加入多糖溶液后的吸光度；

A₂為磷酸緩沖液代替PNPG的吸光度。

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