采用1%鹽水、1%淀粉液和自來水清洗赤霞珠葡萄，破碎后的葡萄漿接種活化后的活性干酵母ST進行發(fā)酵，通過測定發(fā)酵過程中微生物菌群、還原糖、可溶性固形物、乙醇、乙酸及香氣物質的變化，考察不同潔凈度葡萄的葡萄酒發(fā)酵效果。結果表明，1%鹽水和1%淀粉清洗的葡萄原料在發(fā)酵過程中酵母菌生長旺盛、耗糖較快、乙醇和高級醇生成較多，而細菌、霉菌生長和乙酸及酯類化合物生成較少。自來水及對照組(未清洗組)的酵母菌生長較少，耗糖較慢、乙醇和高級醇生成較少，而細菌和霉菌生長、乙酸和總酯生成較多。結果表明，用1%鹽水或1%淀粉液清洗能去除較多的霉菌和細菌，提高釀酒葡萄潔凈度，有利于葡萄酒發(fā)酵產(chǎn)乙醇及風味復雜性。

葡萄酒釀造使用的葡萄通常破碎后直接發(fā)酵，但在夏季高溫多雨的葡萄種植區(qū)，葡萄容易爆發(fā)霜霉病、白粉病、炭疽病等病害，為了不影響葡萄的正常收獲，果農(nóng)們會噴灑殺蟲劑、殺菌劑和除草劑等農(nóng)藥，導致葡萄皮上有一定的農(nóng)藥殘留。研究發(fā)現(xiàn)，殘留的農(nóng)藥會影響葡萄酒釀造過程中酵母的生長代謝，延遲發(fā)酵，產(chǎn)生一些不良代謝產(chǎn)物和異味物質，影響到葡萄酒的口感、香味等感官質量和食用的安全性。另外，葡萄皮上殘留的有害微生物在葡萄發(fā)酵過程中與釀酒酵母菌群爭奪養(yǎng)分，影響發(fā)酵并且會產(chǎn)生有害的副產(chǎn)物，比如醋酸菌可產(chǎn)生大量醋酸，引起葡萄酒的酸敗味，霉菌可使果酒產(chǎn)生霉味等。減少葡萄皮上農(nóng)藥殘留和有害微生物，對葡萄酒正常發(fā)酵、質量及飲用安全性將有一定積極作用。

通常葡萄釀酒不需要清洗原料，主要是利用葡萄表皮附著的微生物進行發(fā)酵。對于泥沙較多的葡萄原料在釀酒前需要對原料進行清洗瀝干處理，但尚鮮見關于清洗葡萄的研究報道。本研究采用1%鹽水、1%淀粉液和自來水對赤霞珠葡萄進行清洗，以不清洗的葡萄原料為對照，通過不同的清洗方法造成葡萄不同的潔凈度，旨在研究不同潔凈度葡萄發(fā)酵的效果，并監(jiān)測不同清洗條件下發(fā)酵過程的菌群生長、還原糖消耗、可溶性固形物變化、乙醇含量、乙酸含量及香氣物質含量變化等，考察不同潔凈度葡萄對葡萄酒發(fā)酵效果的影響，為釀酒葡萄原料的狀態(tài)控制提供理論依據(jù)，以保證正常良好的葡萄酒發(fā)酵過程和終產(chǎn)物葡萄酒質量。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1原料與菌株

赤霞珠葡萄：河北昌黎盧龍華夏基地中糧集團華夏葡萄酒公司；ST活性干酵母：遼寧本溪桓仁五女山米蘭酒業(yè)有限公司。

1.1.2化學試劑

牛肉膏、蛋白胨、酵母浸粉（均為生化試劑）：北京奧博星生物技術責任有限公司；氯化鈉、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、檸檬酸三鐵、硫酸亞鐵、硫酸錳、苯酚、3，5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylicacid，DNS）、葡萄糖（均為分析純）：天津市天河化學試劑廠；玉米淀粉：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；亞硫酸（分析純）：天津市科密歐化學試劑有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeastextractpeptonedextrose，YEPD）培養(yǎng)基：酵母浸粉1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，瓊脂2%，3.2×10⁴U/L青霉素和4×10⁴U/L的鏈霉素（用孔徑為0.22μm的水系膜過濾除菌），調pH至6.0。

肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，蛋白胨1%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，納他霉素25%，調pH至7.2～7.4。

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉0.3%，硫酸鎂0.05%，磷酸氫二鉀0.1%，硫酸亞鐵0.001%，氯化鉀0.05%，蔗糖3%，瓊脂2%，3.2萬單位/L青霉素與4萬單位/L的鏈霉素（用孔徑為0.22μm的水系膜過濾除菌），調pH至6.7。

1.2儀器與設備

UV-5200型分光光度計：上海元析儀器有限公司；PHS-3C型精密pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；H1750R離心機：湘儀離心機儀器有限公司；78-1磁力加熱攪拌器：金壇市金城翔龍儀器廠；DNP-9082型恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實驗設備有限公司；DW-86L-386立式超低溫冰箱：青島海爾特種電器有限公司；LERD-TECH高壓蒸汽滅菌器、Memmert低溫培養(yǎng)箱：北京五洲東方科技發(fā)展有限公司；Agilent7697A頂空進樣器、AgilentGC6850氣相色譜儀：美國安捷倫公司；KT-2000恒溫搖床：常州市中貝儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1活性干酵母的活化及培養(yǎng)

將1gST活性干酵母溶于10mL無菌水，40℃恒溫水浴培養(yǎng)15min，每5min輕微搖動一次，培養(yǎng)完成后得到一級活化液；隨后將10mL稀釋到20°Bx左右的模擬葡萄汁，加入到一級活化液中，25℃恒溫水浴培養(yǎng)1h，每30min輕微搖動一次，培養(yǎng)完成后得到20mL二級活化液，取20mL的40°Bx左右的模擬葡萄汁，加入到二級活化液中，20℃恒溫水浴培養(yǎng)2h，每30min輕微搖動一次。最后得到40mL0.25g/L的酵母種子液。

1.3.2葡萄原料的預處理

將1.8kg成串的赤霞珠葡萄分成3等份，分別浸沒于4L的1%鹽水、1%淀粉水及自來水中，在90r/min搖床清洗10min，撈出后，分別用4L自來水在90r/min的搖床清洗3次，每次清洗5min，自然晾干后將果粒剪下，手帶一次性手套擠壓2層紗布包裹的葡萄果粒，將破碎處理后的葡萄皮和葡萄汁液裝入500mL三角瓶內(nèi)，添加亞硫酸，使SO₂含量為60mg/L，每個處理3個平行。

1.3.3葡萄酒的制備

將上述清洗處理的葡萄的葡萄漿，接種活化的酵母液，使接入的酵母量為10²個/mL。接種后，混合均勻，瓶口安裝發(fā)酵栓，以排放發(fā)酵產(chǎn)生的氣體，在15～18℃靜置發(fā)酵26d，以還原糖不再降低視為發(fā)酵結束。發(fā)酵過程中定期取樣測定微生物菌群、理化指標及主要香氣物質。

1.3.4取樣及樣品預處理

發(fā)酵過程中每3天取樣一次，在取樣前將帶有發(fā)酵栓的玻璃錐形瓶以順時針搖勻。將用于測定還原糖、可溶性固形物和揮發(fā)性物質的樣品離心（4℃、8000r/min條件下離心5min）以除去菌群細胞，保存于-20℃冰箱中待測。

1.3.5分析檢測

(1）菌群的測定

采用稀釋涂平板法測定微生物菌群。將發(fā)酵液適當稀釋后，分別在YEPD培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基和察氏培養(yǎng)基接種0.2mL于30℃靜置培養(yǎng)至菌落不再增加為止，進行酵母菌、細菌和霉菌落計數(shù)。

(2）還原糖含量和可溶性固形物的測定

用DNS法測定還原糖含量。用手持糖量折光儀直接測定可溶性固形物含量。

(3）揮發(fā)性物質含量測定

乙醇、乙酸和香氣成分含量都采用氣相色譜測定。

樣品前處理：依次將1.4gNaCl、磁力攪拌轉子和7mL發(fā)酵上清液加入15mL頂空氣相瓶中，用聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）墊密封，放置在磁力攪拌器上，在250r/min下攪拌10min。

頂空進樣條件：Agilent7697A頂空進樣器；樣品平衡溫度90℃；樣品平衡時間30min；進樣口溫度250℃；檢測器溫度250℃。

氣相色譜條件：AgilentDB-FFAP毛細管色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）；色譜柱初始溫度40℃，穩(wěn)定10min，以5℃/min升溫至180℃，穩(wěn)定1min，然后以20℃/min升溫至230℃，穩(wěn)定2min；空氣流量300mL/min，氫氣流量30mL/min，載氣為氮氣（N₂）流量10mL/min，分流比10∶1，進樣量2μL。

1.3.6統(tǒng)計分析

所有實驗均進行3次平行，數(shù)值表示為3次獨立實驗的“平均值±標準偏差”。使用IBMSPSSStatistics19.0軟件進行顯著性分析，然后以P<0.05的水平確定Duncan。

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