2生物傳感器方法

生物傳感器分析法(BiosensorAnalysis）是以固定化生物活性物質(zhì)（如酶、蛋白質(zhì)、微生物、DNA及生物膜等）為敏感元件，并與適當(dāng)?shù)奈锢砘蚧瘜W(xué)換能器結(jié)合制成的一種分析檢測裝置進(jìn)行分析檢測的方法。1962年，Clark以離子選擇性電極為基礎(chǔ)發(fā)展了具有酶分子識別功能的酶電極。1967年，Updike和Hicks首次將葡萄糖氧化酶（GO）固定在Clark氧電極表面，成功制備了葡萄糖傳感器，從而揭開了有機(jī)物無試劑分析的序幕。繼之又出現(xiàn)了微生物傳感器、免疫傳感器、細(xì)胞傳感器和組織切片傳感器。20世紀(jì)70年代末至80年代，又出現(xiàn)了熱敏電阻型和生物化學(xué)發(fā)光式生物傳感器。這些生物傳感器的出現(xiàn)改變了傳統(tǒng)破壞試樣的生化檢驗(yàn)方法，而且可直接分析、反復(fù)使用，便于操作。日前已經(jīng)發(fā)展到活體內(nèi)測定、多指標(biāo)測定以及聯(lián)機(jī)在線測定。檢測對象也已涉及近百種常見的生物化學(xué)物質(zhì)，使許多過去極難進(jìn)行的檢測變得容易，因而在醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究、臨床診斷、環(huán)境醫(yī)學(xué)以及發(fā)酵、食品、化工和環(huán)保等方面得到廣泛的應(yīng)用。

2.1酶傳感器

酶傳感器是發(fā)展最早，也是目前最成熟的一類生物傳感器。它是在固定化酶的催化作用下，生物分子發(fā)生化學(xué)變化后，通過換能器記錄變化從而間接測定出待測物濃度。目前國際上已研制成功的酶傳感器有20余種，其中最成熟的是葡萄糖傳感器。使用時(shí)將酶電極浸入到樣品溶液中，溶液中的葡萄糖即擴(kuò)散到酶膜上，在固定于酶膜上的葡萄糖氧化酶作用下生成葡萄糖酸，同時(shí)消耗氧氣，通過氧電極測定溶液中氧濃度的變化，推測出樣品中葡萄糖的濃度。MerolaGiovanni等開發(fā)了以過氧化氫的安培電極作為傳感器、過氧化物酶作為標(biāo)記物的酶傳感器。結(jié)果證明了該酶傳感器方法的完全有效性，LOD約為10-10mol/L。羅瑞平[48]合成了金屬改性介孔碳材料，并基于青霉素酶（PenX）設(shè)計(jì)了2種生物傳感器：PenX-COOH-Co@C/PMB/GCE和PenX-COOH-CoS2@C/PMB/GCE生物傳感器、基于新德里金屬-β-內(nèi)酰胺酶-1(NDM-1）設(shè)計(jì)了1種生物傳感器：NDM-1/PMB/GCE傳感器；其中PenX-COOH-Co@C/PMB/GCE和PenX-COOH-CoS2@C/PMB/GCE生物傳感器對青霉素鈉（PenG）的檢測限分別為0.64和0.61ng/mL,NDM-1/PMB/GCE傳感器對氨芐青霉素鈉（AMP）的檢測限為0.35ng/mL，所制備的三種酶傳感器靈敏度高、檢測限低。

2.2電化學(xué)生物傳感器

電化學(xué)生物傳感器是將電化學(xué)傳感器與生物分子特異性識別相結(jié)合的一種生物傳感裝置。它是一種將生物體成分（酶、抗原、抗體、激素等）或生物體本身（細(xì)胞細(xì)胞器、組織等）作為敏感元件，電極（固體電極、離子選擇性電極、氣敏電極等）作為轉(zhuǎn)換元件，以電勢或電流為特征檢測信號的傳感器。傅迎春等以制備的氯霉素DNA適配體修飾的磁珠以及一段與適配體互補(bǔ)的DNA鏈修飾的金電極制成了電化學(xué)生物傳感器，該傳感器檢測氯零素的線性范覆蓋3個(gè)數(shù)量級，檢測限低至1ng/mL，與常規(guī)方法相當(dāng)或更優(yōu)。此外，傳感器具有滿意的特異性、穩(wěn)定性，用于牛奶樣品檢測效果滿意。Mohammad-Razdari[52]等在鉛筆石墨電極（PGE）上制造了基于電化學(xué)適體的生物傳感器。在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，顯示出從10-15到10-5mol/L的寬線性范圍，對SDM的檢測極限（LOD）為3.7×10-16mol/L。此外，它具有很高的重現(xiàn)性，良好的選擇性和可接受的穩(wěn)定性。SuiChengji[53]等使用石墨狀氮化碳（g-C3N4）納米片作為光敏材料，結(jié)合捕獲-釋放策略，制備了一種簡單而選擇性的光電化學(xué)生物傳感器。所開發(fā)的方法顯示出從1pmol/L到100nmol/L的寬線性范圍和0.22pmol/L(3sigma）的低檢測限。制成的光電化學(xué)生物傳感器還具有良好的檢測特異性，可用于檢測水樣中的氯霉素殘留，回收率在94.5%至107.3%之間。

2.3細(xì)胞傳感器

細(xì)胞傳感器的分子識別元件采用動(dòng)植物活細(xì)胞，并結(jié)合傳感器和理化換能器，產(chǎn)生間斷或連續(xù)的光電信號。某些動(dòng)植物活細(xì)胞內(nèi)還有對目標(biāo)分析物具有誘導(dǎo)效應(yīng)的基因，因此可用來制作活體細(xì)胞傳感器，當(dāng)目標(biāo)分析物進(jìn)入活體細(xì)胞中時(shí)，這些基因發(fā)生誘導(dǎo)效應(yīng)，其可以被目標(biāo)分析物激活或抑制，此過程被傳感器捕捉并轉(zhuǎn)化為光電信號，根據(jù)該細(xì)胞中基因?qū)Σ煌股氐恼T導(dǎo)效應(yīng)可測量多種目標(biāo)分析物，其原理是采用DNA重組技術(shù)重構(gòu)細(xì)胞并用于抗生素殘留檢測，細(xì)胞傳感器可分為組成型和誘導(dǎo)型兩種。ChengGuyue等構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因細(xì)菌，帶有質(zhì)粒pRecAlux3的大腸桿菌pK12，以開發(fā)基于生物發(fā)光細(xì)菌的檢測動(dòng)物源性食品中氟喹諾酮類（FQN）的方法。該方法可用于牛奶等11種可食用組織中FQN的檢測。FQN的檢出限在12.5至100μg/kg之間，均低于最大殘留限量。

2.4免疫傳感器

免疫傳感器是將高靈敏的傳感器技術(shù)與特異性免疫反應(yīng)相結(jié)合的一種新方法，用于檢測和監(jiān)控抗原抗體之間的反應(yīng)。免疫傳感器是把抗原或抗體固定在固相支持物表面形成感應(yīng)器，檢測樣品中的抗體或抗原，然后將感應(yīng)的信號通過精密換能器輸出，是一種既有選擇性又能定量檢測的固相免疫測試法。RebeRaz等開發(fā)了基于成像表面等離振子共振（iSPR）平臺的微陣列免疫傳感器，用于定量和同時(shí)免疫檢測牛奶中的不同抗生素殘留。使用單個(gè)傳感器芯片同時(shí)檢測了四大類共7種抗生素。通過競爭形式對7種免疫測定進(jìn)行多重分析，我們能夠在緩沖液和10倍稀釋牛奶中測得十億分之一（ppb）水平的所有目標(biāo)化合物。

2.5微生物傳感器

微生物傳感器的研究始于1977年Rechnitz用糞便鏈球菌制成測精氨酸的傳感器，而現(xiàn)在已有各種各樣的微生物傳感器用于臨床診斷、食品檢測、發(fā)酵監(jiān)控和產(chǎn)物分析、環(huán)境質(zhì)量監(jiān)測等。微生物的多樣性、特異性是發(fā)展檢測各種物質(zhì)和多種功能的眾多傳感器的理論基礎(chǔ)，而且相對于其他生物傳感器，微生物傳感器制作較容易，活性較穩(wěn)定，使用壽命長[62]。KumarSanjay[63]建立了一種基于綠膿桿菌的用于檢測頭孢菌素類抗生素的電位型微生物傳感器；初步結(jié)果表明，銅綠假單胞菌細(xì)胞經(jīng)溶菌酶處理后，在0.1～11mmol/L的濃度范圍內(nèi)對頭孢菌素的檢測效率高于正常細(xì)胞；最佳參數(shù)值：細(xì)胞含量2.5mg/cm2，明膠8.5mg/cm2，戊二醛0.25%。以磷酸鹽緩沖液pH、離子強(qiáng)度和溫度為檢測條件，優(yōu)化了生物傳感器的檢測性能；對不同內(nèi)酰胺類抗生素的特異性檢測，發(fā)現(xiàn)該微生物傳感器僅對頭孢菌素有較好的響應(yīng)，且該微生物傳感器存儲(chǔ)及檢測具有高穩(wěn)定性，在檢測頭孢菌素類藥物方面具有良好的應(yīng)用前景。

3生物芯片技術(shù)

1991年，F(xiàn)odor等首先提出DNA芯片（DNAchip）和微陣列（microarray）的概念。生物芯片（Biochip）技術(shù)是20世紀(jì)90年代初伴隨著人類基因組計(jì)劃的實(shí)施而產(chǎn)生的一門新技術(shù)，已成為高效、大規(guī)模獲取相關(guān)信息的重要手段。它主要通過微加工和微電子技術(shù)在固相基質(zhì)表面構(gòu)建微型生物化學(xué)分析系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞、蛋白質(zhì)、核酸以及其他生物分子等進(jìn)行準(zhǔn)確、快速、高通量檢測。目前，生物芯片技術(shù)已廣泛應(yīng)用于基因序列分析、疾病診斷、藥物研究、微生物檢測、農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)、食品、環(huán)境保護(hù)和檢測等領(lǐng)域。Gaudin等使用專用于六個(gè)不同抗生素殘留物篩查的MicroArrayII試劑盒（AMII）評估了一個(gè)多陣列系統(tǒng)，稱為Evidence Investigator™（Randox,Crumlin,Co.，英國安特里姆，英國），這是一種半自動(dòng)化生物芯片系統(tǒng)，設(shè)計(jì)用于研究、臨床應(yīng)用和獸醫(yī)使用，實(shí)驗(yàn)證明該多陣列生物芯片系統(tǒng)特異性非常令人滿意；驗(yàn)證了六個(gè)抗生素殘基的檢測能力均低于歐盟參考實(shí)驗(yàn)室（EU-RL）于2007年發(fā)布的參考方法所能測定的最低濃度，AMII試劑盒可以檢測至少六個(gè)喹諾酮類，四個(gè)四環(huán)素和三個(gè)差向異構(gòu)體，三個(gè)氨基糖苷類，三個(gè)大環(huán)內(nèi)酯類，甲砜霉素，氟苯尼考和頭孢噻呋以及一種穩(wěn)定的代謝產(chǎn)物二呋喃基頭孢呋喃半胱氨酸二硫化物（DCCD）。

4展望

得益于現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展且動(dòng)物源性食品本身就來源于動(dòng)物體，利用某些生物材料（如酶、抗體、組織、細(xì)胞等）對抗生素物質(zhì)具有的特異性識別能力或靈敏響應(yīng)能力檢測抗生素殘留，是近年來動(dòng)物源性食品中抗生素檢測研究的熱點(diǎn)之一。

在免疫分析的諸方法中，放射免疫分析由于具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)，至今使用仍較多。但放射性污染的弊端也是同樣明顯的。酶聯(lián)免疫分析是最先提出的非放射免疫方法，并在進(jìn)入20世紀(jì)80年代后首次占據(jù)主導(dǎo)地位，且將在今后比較長的一段時(shí)間內(nèi)仍占主導(dǎo)地位，特別是在應(yīng)用方面更將是如此?；瘜W(xué)和生物發(fā)光免疫分析法，由于其高靈敏度和測定簡便的特點(diǎn)使其在免疫分析中始終占有一定的位置。自動(dòng)化、大眾化、與其他技術(shù)的聯(lián)用是免疫分析的重要發(fā)展方向。

相對于物理、化學(xué)傳感器，所有生物傳感器，易受環(huán)境條件的影響，不夠穩(wěn)定，敏感元件使用壽命短，要經(jīng)常更換固定化生物膜。生物傳感器發(fā)展中的問題著微電子、分子生物學(xué)、計(jì)算機(jī)和材料等科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，多種學(xué)科技術(shù)的相互交叉應(yīng)用的推進(jìn)，將會(huì)順利解決，而且將會(huì)有更多更好的各種用途的生物傳感器出現(xiàn)。未來生物傳感器將更趨向微型化、集成化、智能化。未來的生物傳感器將集合體積小、功能強(qiáng)、響應(yīng)快、靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)，成為一種廣泛應(yīng)用的高科技生物分析技術(shù)。

基因芯片技術(shù)不過短短幾年時(shí)間，其發(fā)展勢頭非常迅猛，在生命科學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域得到普遍應(yīng)用，但其存在的缺陷也顯而易見。首先是資本的問題，由于芯片制作的工藝龐大，信號檢測也需專門的儀器配置，普通實(shí)驗(yàn)室難以負(fù)擔(dān)其高昂的用度；其次在芯片實(shí)驗(yàn)技術(shù)上尚有多個(gè)問題需要解決，如探針合成等。

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