樺剝管菌隸屬于真菌門(mén)、擔(dān)子菌亞門(mén)、層菌綱、非褶菌目、多孔菌科、剝管菌屬，又稱(chēng)為樺多孔菌、樺滴孔菌或樺孔菌，是樺木屬樹(shù)木專(zhuān)有性木腐菌。其形態(tài)特征：子實(shí)體中大型(最大直徑可達(dá)30cm)，無(wú)柄或幾乎無(wú)柄，上部為扁半球形，下部為扁平形，生長(zhǎng)初期為污白褐色，后期為褐色。表面有一層褐色的薄薄的表皮，撕去后可露出白色的菌肉，邊緣內(nèi)卷(圖1，照片由延邊華夏桑黃菌業(yè)有限公司提供)。菌肉很厚實(shí)，近肉質(zhì)且口感滑嫩，經(jīng)過(guò)晾曬脫水后，菌肉會(huì)成為較輕的革質(zhì)狀。樺剝管菌分布地區(qū)廣泛，陜西、福建、安徽、黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、甘肅、四川、云南、貴州、新疆、西藏、河南、湖南等地區(qū)。

樺剝管菌既是能夠高效地降解木質(zhì)纖維素的褐腐菌，也是一種實(shí)用真菌與藥用真菌。樺剝管菌多糖是樺剝管菌的主要活性成分之一，具有消炎、抑菌的功能，同時(shí)，樺剝管菌多糖具有“二抗作用”，即抗病毒和抗癌作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)樺剝管菌的降解木材能力以及提取物的研究較多，而有關(guān)研究和應(yīng)用樺剝管菌多糖的報(bào)道較少，樺剝管菌為一年生真菌，產(chǎn)量高且在我國(guó)儲(chǔ)量豐富，本研究以樺剝管菌子實(shí)體干品為實(shí)驗(yàn)材料，采用響應(yīng)面法優(yōu)化樺剝管菌多糖超聲輔助提取工藝，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken(BBS)實(shí)驗(yàn)，確定樺剝管菌多糖最佳提取工藝條件，并對(duì)其進(jìn)行抗氧化活性研究，以期為樺剝管菌的開(kāi)發(fā)、研究與利用提供科學(xué)的理論依據(jù)。

一、材料與方法

1、材料與試劑

樺剝管菌子實(shí)體干品，2017年11月購(gòu)于延邊華夏桑黃菌業(yè)有限公司。

葡萄糖、苯酚、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、H202、抗壞血酸(VC)、1-1-二苯基-2-苦肼基(DPPH)、95％乙醇，以上試劑均為分子純。

2、儀器與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)所用儀器、設(shè)備如表1所示。

3、方法

（1）樺剝管菌多糖的提取工藝流程

樺剝管茵子實(shí)體干品→烘干至恒質(zhì)量→樺剝管茵粉→取19樺剝管茵粉加水調(diào)配液料比→水浴提取→超聲波處理→離心→稀釋100倍→苯酚→硫酸法顯色→490nm測(cè)定吸光值。

（2）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取105℃、4h烘干至恒重的葡萄糖50mg定容于500mL容量瓶中，配成0.1mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、lmL于大試管中，補(bǔ)加蒸餾水至1.0mL。分別精密移取上述葡萄糖溶液1mL，分別加6％苯酚溶液0.5mL，濃硫酸2.5mL，震蕩搖勻，室溫放置10min后于490nm測(cè)定吸光值。

（3）樺剝管菌多糖含量及得率的測(cè)定

采用苯酚-硫酸法進(jìn)行樺剝管菌多糖含量的測(cè)定。準(zhǔn)確吸取樣品溶液lmL于試管中，分別加6％苯酚溶液0.5mL，濃硫酸2.5mL，震蕩搖勻，室溫放置10min后于490nm測(cè)定吸光值。根據(jù)測(cè)得的吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算得樺剝管菌多糖濃度。再將多糖濃度帶入以下公式，計(jì)算樺剝管菌多糖得率：

樺剝管菌子實(shí)體多糖得率(％)=C×V×n/m×100％，其中，C是測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度；V是提取液總體積；n是稀釋的倍數(shù)；m是樺剝管菌子實(shí)體粉末質(zhì)量。

（4）樺剝管菌多糖提取單因素實(shí)驗(yàn)

按工藝流程方法提取樺剝管菌多糖，選擇水浴溫度、超聲溫度、超聲時(shí)間、超聲功率、液料比進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以樺剝管菌多糖得率為研究指標(biāo)，考察各個(gè)因素對(duì)樺剝管菌多糖得率的影響。不同因素梯度條件見(jiàn)表2。

（5）超聲波輔提樺剝管菌多糖工藝的Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇水浴溫度(A)、超聲功率(B)、料液比(C)為自變量，樺剝管菌多糖得率(Y)為響應(yīng)值，應(yīng)用Design—Expert.V8.0.6軟件的Box-Behnken(BBD)實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)3因素3水平響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，對(duì)超聲波輔提樺剝管菌多糖的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。實(shí)驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)表，見(jiàn)表3。

（6）羥基自由基清除力測(cè)定

根據(jù)H₂O₂與Fe²⁺作用產(chǎn)生羥基自由基，并使水楊酸顯色的方法測(cè)定羥基自由基清除能力。參照林琳的實(shí)驗(yàn)方法并做適當(dāng)修改。分別精確配制0.125mg/mL、0.25mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL、2.0mg/mL、4.0mg/mL、8mg/mL樣品多糖溶液，依次在試管中加入1.0mL的FeSO。溶液(9mmol/L)，1.0mL的不同濃度的樺剝管菌多糖溶液，1.0mL的H202溶液(0.03％)和1.0mL的水楊酸溶液(9mmol/L)。將反應(yīng)液置于37℃水浴30min，在510nm處測(cè)定各反應(yīng)液的吸光值?？瞻捉M的多糖溶液由蒸餾水代替。對(duì)照組用同等濃度的VC溶液代替多糖溶液。按照下式計(jì)算羥基自由基的清除率。

羥基自由基清除率(％)=(Ao-A)/Ao×100％，其中，Ao：空白組的吸光值；A：樣品組的吸光值。

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