食品安全一直受到廣泛關(guān)注，在實(shí)現(xiàn)食品中污染物準(zhǔn)確檢出的前提下，快速方便的檢測(cè)方式對(duì)食品安全的維持具有重要現(xiàn)實(shí)意義。滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification， RCA)發(fā)展于20世紀(jì)90年代中期，是一種簡(jiǎn)單高效的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)，可在等溫的條件下快速擴(kuò)增出由模板互補(bǔ)序列串聯(lián)而得的長(zhǎng)單鏈DNA。由于其引物易于標(biāo)記固定和其模板設(shè)計(jì)多樣性，RCA應(yīng)用于生物傳感器中以及在提高傳感器的檢測(cè)靈敏度方面具備顯著優(yōu)勢(shì)，因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及食品安全等生物技術(shù)領(lǐng)域的研究中。本文綜述了近幾年RCA技術(shù)在食源性致病微生物、生物毒素、農(nóng)藥獸藥殘留、重金屬等食品安全危害因子檢測(cè)中的研究與應(yīng)用進(jìn)展，并展望了該技術(shù)在食品安全檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展方向。

引言

食品在生產(chǎn)加工的各個(gè)環(huán)節(jié)中都可能受到污染物的影響，長(zhǎng)期攝入有安全隱患的食物會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生不利影響。將食品中有毒有害污染物準(zhǔn)確、快速、便捷地檢出是科學(xué)有效地處理被污染食品的必要前提。核酸的體外擴(kuò)增經(jīng)過30多年的發(fā)展，已成為生命科學(xué)發(fā)展中一種不可或缺的重要技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)是目前廣泛應(yīng)用的核酸體外擴(kuò)增方法，但有依賴熱循環(huán)步驟，可能會(huì)對(duì)某些重要生物分子產(chǎn)生破壞并且不利于實(shí)驗(yàn)室外實(shí)施。發(fā)展于20世紀(jì)90年代初的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可有效地實(shí)現(xiàn)核酸序列的快速積累，這類擴(kuò)增技術(shù)根據(jù)第一步反應(yīng)的特征，可被分為兩大類：一類依賴于特異性引物延伸，包括環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(rolling circle amplification，RCA)和依賴解旋酶擴(kuò)增技術(shù)(helicase-dependent amplification，HAD)等；另一類是依賴于限制性內(nèi)切酶，包括鏈置換擴(kuò)增技術(shù)(strand displacement amplification，SDA)、切口酶擴(kuò)增反應(yīng)(nicking enzyme amplification，NEAR)以及切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)擴(kuò)增技術(shù)(nicking enzyme mediated amplification，NEMA)等。其中RCA具有多項(xiàng)實(shí)用性能。首先，RCA產(chǎn)物由大量的具有高度可操作性的重復(fù)序列組成，擴(kuò)增模板的多樣設(shè)計(jì)可以實(shí)現(xiàn)多種應(yīng)用目的，例如擴(kuò)增核酸適配體、DNA模擬酶等功能核酸以及信號(hào)探針互補(bǔ)位點(diǎn)、限制性酶位點(diǎn)等。

另外，通過引物序列的修飾或者設(shè)計(jì)，可將RCA擴(kuò)增產(chǎn)物直接固定于試條紙、微孔板、微流控芯片以及納米顆粒等載體上，或者連接在核酸適配體、蛋白質(zhì)等生物大分子上，這使RCA可靈活地與其他分離檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合。RCA技術(shù)在原位檢測(cè)、微量物質(zhì)測(cè)定、核酸診斷、單堿基多態(tài)性和藥物研發(fā)等研究和分子診斷中有大量的相關(guān)研究報(bào)道并已有商業(yè)化產(chǎn)品出現(xiàn)。例如，上海易色醫(yī)療生產(chǎn)的“一步法恒溫支原體檢測(cè)試劑盒”其靈敏度高于普通PCR(30 cycles)80倍；華大基因通過使用美國(guó)Complete Genomics公司基于RCA開發(fā)的DNA納米球基因測(cè)序技術(shù)，發(fā)布了桌面化測(cè)序系統(tǒng)BGISEQ-500，其基因組檢測(cè)精度可達(dá)99.99%。圖1對(duì)1995年以來每年發(fā)表的RCA相關(guān)文獻(xiàn)數(shù)量進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)，2014年以來，RCA相關(guān)文獻(xiàn)總量以每年200余篇的數(shù)量增加，表明了RCA技術(shù)的應(yīng)用研究潛力和科學(xué)界對(duì)其的持續(xù)關(guān)注。目前，已有文獻(xiàn)對(duì)RCA在醫(yī)療診斷、生物檢測(cè)等領(lǐng)域進(jìn)行了回顧，但未見其在食品安全方面應(yīng)用的綜述。因此，本文從RCA技術(shù)的原理和特點(diǎn)出發(fā)，重點(diǎn)歸納總結(jié)了近年來RCA技術(shù)在食品安全檢測(cè)中的應(yīng)用，系統(tǒng)梳理了其研究應(yīng)用階段性成果，以期拓寬該技術(shù)在食品安全隱患的快速篩查的應(yīng)用發(fā)展。

1 RCA技術(shù)簡(jiǎn)介

1.1 RCA技術(shù)原理

RCA技術(shù)是對(duì)自然界中的某些轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒和病毒基因組的滾環(huán)復(fù)制的模擬而提出的。20世紀(jì)90年代中期，美國(guó)卡內(nèi)基研究所的FIRE團(tuán)隊(duì)以及斯坦福大學(xué)的Kool團(tuán)隊(duì)先后描述了RCA。一般地，RCA可分為模板的連接成環(huán)和滾環(huán)擴(kuò)增兩部分。以常用的鎖式探針模板(padlock probe，PLP)為例，PLP長(zhǎng)度在100 bp以內(nèi)，主要由兩部分組成：(1)與引物反向互補(bǔ)的5'-磷酸化檢測(cè)臂(T1)和3'-檢測(cè)臂(T2)；(2)功能區(qū)域Zip，位于T1和T2之間，為RCA產(chǎn)物中的功能性序列提供模板。如圖2a所示，在連接成環(huán)時(shí)，退火后的PLP與初始引物雜交，T1與T2相鄰而形成的裂口在DNA連接酶的作用下閉合生成環(huán)狀DNA模板。擴(kuò)增步驟由具有連置換性的DNA聚合酶介導(dǎo)，圖2b展示了經(jīng)典的線性RCA(linear rolling circle amplification，LRCA)的擴(kuò)增過程，在恒定溫度下，DNA聚合酶將d NTPs添加到擴(kuò)增引物5'端。當(dāng)產(chǎn)物鏈在模板上延伸一周后，由于酶的鏈置換性，已擴(kuò)增出的產(chǎn)物鏈的脫氧核糖核苷酸依次從模板上被置換，以進(jìn)行下一個(gè)核苷酸的延伸。RCA的擴(kuò)增過程如同拉出一卷卷尺，因此最終的RCA擴(kuò)增產(chǎn)物是一個(gè)由含數(shù)百至數(shù)千個(gè)重復(fù)序列單體串聯(lián)而組成的長(zhǎng)ss DNA。

1.2 RCA技術(shù)特點(diǎn)

RCA具有高度靈敏性和特異性。在一個(gè)靶標(biāo)分子對(duì)應(yīng)一個(gè)引物的RCA生物傳感器中，理論上可以實(shí)現(xiàn)1個(gè)拷貝的靈敏度。RCA反應(yīng)條件溫和，儀器簡(jiǎn)單，在常見的恒溫儀器(如水浴、恒溫培養(yǎng)箱)中即可進(jìn)行擴(kuò)增。RCA擴(kuò)增的最適溫度接近生理溫度，溫和的反應(yīng)條件使RCA甚至可以在生物體中進(jìn)行。RCA具有高效的擴(kuò)增能力和信號(hào)放大能力。研究發(fā)現(xiàn)，Phi29 DNA聚合酶參與的LRCA能夠產(chǎn)生長(zhǎng)達(dá)105個(gè)堿基長(zhǎng)度的擴(kuò)增產(chǎn)物；使用2個(gè)擴(kuò)增引物的超支化滾環(huán)擴(kuò)增(hyperbranched rolling circle amplification，HRCA)可在90 min內(nèi)產(chǎn)生109的信號(hào)放大效果。為進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)RCA的信號(hào)放大，使用多個(gè)擴(kuò)增引物的多引物RCA(multiple primers rolling circle amplification，MRCA)已在近年被應(yīng)用。而在已報(bào)道的應(yīng)用中，基于RCA信號(hào)放大的生物傳感器通?？蓪?duì)pmol/L乃至amol/L級(jí)濃度的靶標(biāo)物進(jìn)行檢測(cè)。另一方面，不同于PCR對(duì)低豐度被檢核酸的擴(kuò)增，RCA擴(kuò)增的是靶向設(shè)計(jì)的核酸序列，設(shè)計(jì)的模板多樣性決定了擴(kuò)增模式和擴(kuò)增產(chǎn)物的多樣性，因此，RCA應(yīng)用于傳感器中可實(shí)現(xiàn)多種信號(hào)形式的放大。

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