2、HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

按上述色譜條件，以自制花椒麻味物質(zhì)為標(biāo)樣，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，樣品有三個(gè)主峰，保留時(shí)間在22～24min之間，如圖4所示。再將標(biāo)準(zhǔn)品(55μg／mL)用甲醇將其配制成一系列梯度的花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)使用液(μg／mL)：0、10、20、30、40、45。分別精密量取20μg標(biāo)準(zhǔn)使用液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。以保留時(shí)間在22～24min的峰為目的峰，以其HLPC峰面積之和作為縱坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)標(biāo)樣的濃度作為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖5)。

算得出該曲線(xiàn)的回歸方程為：y=421097x+73819(R²=0.9994)

3、高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)法的技術(shù)指標(biāo)研究

（1）HPLC方法的檢出限

本研究用高效液相色譜法檢測(cè)花椒麻味物質(zhì)的檢出限(圖6)。檢出限附近的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.2623x+0.0l(R2=0.9716)，其標(biāo)準(zhǔn)差為0.0063；應(yīng)用公式計(jì)算出該方法的檢出限為0.0339μg/mL。

(2)方法的準(zhǔn)確度

取4份已知花椒麻味物質(zhì)含量的樣品，再各分成兩份，一份不加入花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品(A樣)，另一份加入標(biāo)準(zhǔn)品(B樣)?；ń仿槲段镔|(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的加入量分別為1.4、1.6、1.8、2.0μg/mL。應(yīng)用上述HPLC法測(cè)定A、B樣中花椒麻味物質(zhì)的含量，測(cè)定結(jié)果如表l所示。當(dāng)花椒麻味物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入量為1.4μg/mL時(shí)，回收率范圍為87.8％～112.8％；加入量為1.6μg/mL時(shí)，回收率范圍為90.0％～107.5％；加入量為1.8μg/mL時(shí)，回收率范圍為94.4％～105.0％；加入量為2.0μg/mL時(shí)，回收率范圍為98.0％～103.5％。

（3）方法的精密度

在檢測(cè)條件：島津LC-10AT型分析型高效液相色譜儀，HC-C18型色譜柱，以1.0mL／min15min50％甲醇和水溶液梯度洗脫，10min70％甲醇和水溶液洗脫，柱溫為35℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)254nm。取10組均勻樣品，預(yù)處理后分別采用HPLC法測(cè)定花椒麻味物質(zhì)的含量，連續(xù)、精確重復(fù)測(cè)定lO次，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。10組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(變異系數(shù))均小于5％，其變動(dòng)范圍為0.20％～1.6l％，說(shuō)明這一方法具有較好的重復(fù)性。

三、討論

花椒麻味物質(zhì)具有多種生理活性及食用價(jià)值，但對(duì)花椒有效成分的開(kāi)發(fā)和利用方面仍不足，未充分發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)。定量測(cè)定花椒麻味物質(zhì)含量方法為花椒質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)和食品工業(yè)中花椒原料的選擇可提供一定的理論依據(jù)。目前用到的定量測(cè)試方法主要有高效液相色譜法、氣質(zhì)聯(lián)用法、氣相色譜法、薄層層析法、近紅外光譜法、紫外分光光度法以及基于甲醛滴定快速測(cè)定法。HPLC在物質(zhì)含量的定量檢測(cè)方面應(yīng)用較為廣泛，其原理為：通過(guò)檢測(cè)器的響應(yīng)信號(hào)和檢測(cè)器中物質(zhì)的含量與成正比，利用峰面積大小來(lái)反映溶液中溶質(zhì)含量。目前，文獻(xiàn)中用HPLC法對(duì)花椒麻味物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)方法中所采用的洗脫劑種類(lèi)、色譜柱類(lèi)型等都各不相同，考慮到實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、色譜柱性能、價(jià)格等因素，我們?cè)谘芯恐羞x用了最常見(jiàn)、分離效果好、價(jià)格適中的HC—C₁₈柱。

在預(yù)備實(shí)驗(yàn)中，用反相薄層層析法對(duì)花椒麻味物質(zhì)進(jìn)行分析研究，研究發(fā)現(xiàn)采用70％的甲醇和水溶液作展層劑能有較好的分離效果，因此在HPLC分析中，也以適量濃度的甲醇和水溶液作為流動(dòng)相。研究發(fā)現(xiàn)，采用甲醇和水溶液的梯度洗脫時(shí)分離效果較好，根據(jù)數(shù)次實(shí)驗(yàn)后確定的流動(dòng)相濃度為：初始濃度為溶液濃度為50％，結(jié)束時(shí)溶液濃度為70％。研究中發(fā)現(xiàn)柱溫為35℃時(shí)，理論塔板數(shù)最高，洗脫峰時(shí)間間隔最大，花椒麻味物質(zhì)含量在0～300μg／mL范圍內(nèi)，花椒麻味物質(zhì)含量和響應(yīng)峰面積具有較高的線(xiàn)性相關(guān)度。

綜上所述，用上述方法，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的麻味物質(zhì)出峰位置一致，目標(biāo)峰無(wú)拖尾、無(wú)分叉、分離度高，說(shuō)明高效液相色譜法能將花椒麻味物質(zhì)從其他物質(zhì)中較好地分離出來(lái)。通過(guò)HPIC對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)該方法的技術(shù)指標(biāo)：檢出限為0.0339μg／mL，回收率87.8％～112.8％，重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中花椒麻味物質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差的變動(dòng)范圍為O.20％～1.61％，該方法其準(zhǔn)確度和精密度都較好。花椒麻味物質(zhì)能定量來(lái)衡量花椒品質(zhì)的優(yōu)劣，為進(jìn)一步研究花椒有效成分和花椒質(zhì)量管理奠定了良好的理論基礎(chǔ)，從而推動(dòng)我國(guó)花椒產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

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