霉菌是營(yíng)寄生或腐生方式生存的絲狀真菌的通稱，無(wú)明顯的子實(shí)體，這一點(diǎn)與同樣營(yíng)寄生或腐生方式生存但能形成大型子實(shí)體的蘑菇類真菌相區(qū)別。霉菌有著極強(qiáng)的繁殖能力，主要依靠形形色色的無(wú)性或有性孢子進(jìn)行繁殖。霉菌的滋生是導(dǎo)致果蔬、糧食和食品腐敗變質(zhì)的主要原因之一，如在我國(guó)果蔬損失的25%～30%，糧食損失的10%是由霉菌滋生引起的，其數(shù)量龐大的孢子是導(dǎo)致其快速傳播繁殖的主要方式，部分霉菌還能產(chǎn)生霉菌毒素，具有致癌性或其他毒性。迄今為止，人類已經(jīng)開(kāi)發(fā)了數(shù)十種的抗霉菌劑商品（保鮮劑、防腐劑）來(lái)應(yīng)對(duì)上述問(wèn)題，它們?cè)诰徑夤?、糧食和食品腐敗變質(zhì)方面發(fā)揮了無(wú)可替代的重要作用。然而，由于長(zhǎng)期的使用，使得微生物的抗藥性也在不斷地增強(qiáng)，抗霉菌劑的抗菌效果正在不斷下降甚至失效，因此只有不斷地開(kāi)發(fā)新的抗霉菌劑資源，多種抗霉菌劑輪換或組合使用，才能有效地應(yīng)對(duì)抗藥性，減少果蔬、糧食和食品腐敗變質(zhì)的發(fā)生。

從獼猴桃表皮分離到一株黑附球菌菌株YP1，其分泌物具有廣譜的抗霉菌活性，對(duì)多孢子植物病原真菌也具有很好的抑制效果，在果蔬、食品的保鮮防腐以及植物病害的防治領(lǐng)域顯示出很好的應(yīng)用潛力。

一、材料與方法

1、材料

備篩真菌菌株：共70株，分離于不同種類的植物體，由本研究小組分離保存；測(cè)試霉菌：為本實(shí)驗(yàn)室分離保存；

植物病原菌：購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏中心；化學(xué)試劑：均為分析純；真菌DNA提取試劑盒、ITS1和ITS4引物：購(gòu)于北京三博遠(yuǎn)志公司。

2、儀器

島津UFLC-20A高效液相色譜儀；美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司TripleQTOF5600+質(zhì)譜儀。

3、方法

（1）拮抗菌株的初篩

黑根霉孢子萌發(fā)抑制法：將70株待篩選真菌菌株的斜面菌種活化后，接入盛有100mL液體PDA的250mL錐形瓶中，28℃靜置培養(yǎng)20d左右，棄菌絲，發(fā)酵液過(guò)濾，取9mL發(fā)酵液，加入1mL黑根霉孢子懸浮液（生理鹽水配制），混勻，另取9mL經(jīng)10倍稀釋的液體PDA，加入1mL黑根霉孢子懸浮液混勻作為對(duì)照，待測(cè)樣品與對(duì)照同時(shí)置于28℃靜置培養(yǎng)6h，懸滴法制片，于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率，通常以芽管長(zhǎng)度超過(guò)孢子直徑的一半作為萌發(fā)標(biāo)準(zhǔn)。

（2）拮抗菌株YP1的鑒定

使用真菌DNA提取試劑盒提取YP1菌株的總DNA，以總DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物對(duì)YP1菌株的全長(zhǎng)ITS序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物由北京三博遠(yuǎn)志公司完成測(cè)序。將獲得的ITS序列送入NCBI官方網(wǎng)站，使用BLAST程序進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征確認(rèn)YP1菌株的最終分類學(xué)地位。

（3）拮抗菌株YP1外分泌物的發(fā)酵制備

將YP1菌株斜面菌種活化后，接入盛有100mL液體PDA的250mL錐形瓶中，10瓶共1000mL培養(yǎng)液，28℃靜置培養(yǎng)20d左右，棄菌絲，發(fā)酵液過(guò)濾后合并，用HCl調(diào)pH至4.5，1/4體積乙酸乙酯萃取2遍，發(fā)酵液中橙黃色物質(zhì)全部轉(zhuǎn)入乙酸乙酯中，合并乙酸乙酯相，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮后，倒入廣口皿中用吹風(fēng)機(jī)吹干，得橙黃色膠狀固體，稱量計(jì)算產(chǎn)量。取部分固體進(jìn)行簡(jiǎn)單的溶解性和光熱穩(wěn)定性分析。

（4）拮抗菌株YP1外分泌物對(duì)各種霉菌的拮抗效果分析

①對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的影響

準(zhǔn)確稱量200mg分泌物固體，將其溶解于稀Na2CO3溶液中，用稀鹽酸將溶液的pH調(diào)至7.5作為母液備用，母液終體積為50mL，終濃度為4g/L。取上述分泌物母液適量，加入到適量體積液體PDA中，使液體PDA中分泌物終濃度達(dá)到200mg/L，以不加分泌物的液體PDA作為對(duì)照，兩種培養(yǎng)基分裝編號(hào)。將不同霉菌的孢子懸浮液一式兩份分別加入到上述兩種培養(yǎng)基中，混勻，于28℃靜置培養(yǎng)6h，懸滴法制片，于顯微鏡下統(tǒng)計(jì)孢子萌發(fā)率。

②對(duì)霉菌平板生長(zhǎng)的影響

將固體PDA培養(yǎng)基熔化，冷卻至50～60℃時(shí)，將上述分泌物母液通過(guò)無(wú)菌過(guò)濾器加入到PDA培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中分泌物終濃度達(dá)到200mg/L，充分混勻后倒平板，將各種供試霉菌菌餅（5mm）分別接入上述已經(jīng)混有分泌物的PDA平板中央，對(duì)照PDA平板不加分泌物，接種霉菌菌餅后作為對(duì)照，置于28℃條件下培養(yǎng)，由于不同霉菌生長(zhǎng)速度不同，每種霉菌在對(duì)照平板接近長(zhǎng)滿時(shí)即停止培養(yǎng)，拍照留底。

（5）拮抗菌株YP1外分泌物的化學(xué)組成分析

將拮抗菌株YP1外分泌物復(fù)溶于乙酸乙酯（添加0.1%體積的濃鹽酸酸化）中，使其濃度達(dá)到0.2mg/mL，取5μL上樣于高壓液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對(duì)其化學(xué)成分進(jìn)行分離和鑒定，高壓液相采用XDB-C18柱，甲醇（0.1%甲酸+5mM乙酸銨）作洗脫劑，流速0.2mL/min，質(zhì)譜儀選用ESI電離源，掃描范圍：50～2000m/z。

二、結(jié)果與分析

1、拮抗菌株的初篩

采用黑根霉孢子萌發(fā)抑制法從70個(gè)真菌菌株中初步篩選到一株對(duì)黑根霉的孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈抑制效果的真菌菌株YP1，其發(fā)酵濾液處理黑根霉孢子，孢子萌發(fā)率為0，而對(duì)照萌發(fā)率為93%，依據(jù)如下公式計(jì)算抑制率為100%。

孢子萌發(fā)抑制率=（對(duì)照孢子萌發(fā)率–處理孢子萌發(fā)率）/對(duì)照孢子萌發(fā)率2、拮抗菌株YP1的鑒定以真菌DNA提取試劑盒提取到的YP1菌株的總DNA為模板，以ITS1和ITS4為引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得了YP1接近全長(zhǎng)的ITS序列，測(cè)序后送入NCBI官方網(wǎng)站，使用BLAST程序進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果顯示其與附球孢菌屬的黑附球菌具有最高的相似性（99%），同時(shí)YP1菌株的形態(tài)和生理特征與王宇等和Fávaro等對(duì)黑附球菌的描述一致，因此將其鑒定為黑附球菌。

在PDA平板上，YP1菌落平展，菌絲體大部分埋生，初期僅表面為橙黃色，后期整個(gè)菌落都變?yōu)槌赛S色乃至棕黃色，培養(yǎng)基的顏色也由無(wú)色變?yōu)槌赛S色至后期為深棕黃色。分生孢子產(chǎn)生較少，不易被觀察，單生，頂生，球形或梨形，深褐色。

3、拮抗菌株YP1外分泌物的發(fā)酵制備及其溶解性、穩(wěn)定性分析

YP1菌株在液體發(fā)酵過(guò)程中可向PDA培養(yǎng)基中分泌橙黃色物質(zhì)，用鹽酸調(diào)整發(fā)酵液pH4.5，經(jīng)乙酸乙酯萃取、減壓濃縮、吹干，得橙黃色膠狀固體，產(chǎn)量為463mg/L（靜置培養(yǎng)20d產(chǎn)量），分泌物易溶于極性有機(jī)溶劑，在水中的溶解性隨著pH的升高而迅速增強(qiáng)，pH5以下難溶于水。分泌物水液對(duì)紫外線、強(qiáng)烈日光或120℃以上溫度敏感，處理后褪色成為無(wú)色物質(zhì)，在100℃以下溫度時(shí)比較穩(wěn)定，干燥固體則不受前述因素影響，表現(xiàn)穩(wěn)定。

4、拮抗菌株YP1外分泌物對(duì)各種霉菌的拮抗效果分析

以不摻分泌物的液體PDA為對(duì)照，通過(guò)分泌物摻入和孢子懸浮培養(yǎng)，觀察不同霉菌孢子的萌發(fā)情況，計(jì)算摻入分泌物對(duì)霉菌孢子萌發(fā)的抑制效果（表1）。

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